黃桷蘭乙醇溶液對小鼠止癢作用的初步研究

張銳　凌瑜雙

〔摘要〕 目的 探討黃桷蘭乙醇溶液是否對蚊癢小鼠有治療作用。方法 選擇健康成年昆明小鼠60只，雌雄各半，在其耳后注射磷酸組胺建立瘙癢模型。根據體質量隨機分組，每組10只，將不同濃度組（高、中、低）的黃桷蘭乙醇溶液和其他處理組的藥物涂抹于小鼠耳后，觀察并記錄用藥后30 min之內小鼠的搔抓次數和搔抓潛伏期；斷頭取血，用ELISA法檢測血清中IL-6的濃度；取耳后皮膚制作病理切片觀察炎癥細胞浸潤、增生程度；用SPSS 20.0對數據進行統計學分析。結果 低濃度（0.02 g/mL）的黃桷蘭乙醇溶液可以明顯減少搔抓次數（P<0.05），高濃度（0.5 g/mL）的黃桷蘭乙醇溶液對炎癥細胞的浸潤、增生有顯著的抑制作用，各組間血清IL-6濃度差異無統計學意義（P>0.05）。結論 黃桷蘭乙醇溶液對小鼠瘙癢有一定的抑制作用，且低劑量溶液止癢效果好，但尚需在以后的研究中擴大樣本量進行進一步研究，進而探討黃桷蘭乙醇溶液的作用機制。

〔關鍵詞〕 瘙癢；黃桷蘭；組胺；IL-6

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.05.005

Preliminary Study of Antipruritic Effect of Huangjuelan Ethanol Solution on Mice

ZHANG Rui1， LING Yushuang2， LIANG He3， XIONG Qiang1， DIAO Hua1， WANG Yang4*

（1.College of Public Health and Administration， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China； 2. Center for Disease Control and Prevention of Bishan District， Chongqing 402760， China； 3. Xiangtan Health Supervision Institute， Xiangtan， Hunan 411100， China； 4. Experimental Teaching and Management Center， Chongqing Medical University， Chongqing 401331， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the antipruritic effect of Huangjuelan ethanol solution on the mosquito biting model mice. Methods 60 mice， half male and half female， were selected and 10 mice in each group. Itching model was established through the intradermal injection of histamine phosphate at the back of mouse ear. Different concentrations of Huangjuelan ethanol solution and other treatment were applied on the mouse ear， scratching frequency and scratching latency were observed and recorded within 30 minutes at the wake of intradermal injection of histamine phosphate. All the mice were sacrificed by cutting heads， blood was collected. Serum concentration of IL-6 was detected with ELISA. Skin tissues of mice ear were collected to prepare for the pathological section， inflammatory cell infiltration as well as hyperplasia degree was observed under microscope. SPSS 20.0 was used for statistical analysis. Results The low concentration of Huangjuelan ethanol solution （0.02 g/mL） reduced the scratching frequency significantly （P<0.01）， while high concentration of Huangjuelan ethanol solution （0.5 g/mL） could significantly inhibit the inflammatory cell infiltration and hyperplasia of mouse ear. No significant difference in serum IL-6 concentration was observed among these groups （P>0.05）. Conclusion Huangjuelan ethanol solution has a certain inhibitory effect on itching in mice， and low concentration of Huangjuelan solution shows better inhibitory effect. Therefore， it is still necessary to increase the sample size in future studies， and then to explore the mechanism of action of ethanol solution of this plant.

〔Keywords〕 itching； Huangjuelan ethanol solution； histamine； IL-6

瘙癢是主要由化學介質、機械損傷和熱刺激等因素引起的一種非常不愉快的感覺，在一定程度上給患者的生理、心理及社會活動等方面造成嚴重的影響，從而降低患者生活質量[1]。瘙癢會導致皮膚出現抓痕、色素沉著。不僅如此，瘙癢還能使人們出現尷尬、煩悶、焦慮、抑郁等情緒波動，間接影響人們的身體健康，進而嚴重影響人們的日常生活[2-4]。目前對瘙癢的發病機制尚不清楚，但組胺被認為是人類瘙癢的主要介質之一，其在各類蕁麻疹、昆蟲咬傷反應、表皮肥大細胞增生病或藥物性皮炎所引起的瘙癢中起介導作用[5]。

蟲咬皮炎，又稱丘疹性蕁麻疹，指昆蟲叮咬人類皮膚而引起的炎性皮膚病，常于好發部位出現局部紅腫、丘疹、風團或淤點，表面可出現水皰及大皰，皮損中心可見叮咬痕跡[6-7]。現今針對蟲咬性皮炎的治療方法主要包括內服抗組胺藥物、適當選用外用安撫止癢藥物等。常用的外用止癢藥物如爐甘石洗劑等，效果比較理想，但是在使用后，殘留在皮膚表面的藥物會影響個人美觀，給社交活動造成不便。而某些外用藥如復方醋酸地塞米松乳膏（俗名皮炎平），含有一定劑量的糖皮質激素。長期大量使用糖皮質激素會導致局部皮膚變黑萎縮、引起毛囊炎、毛細血管擴張及血糖升高、血壓升高等不良反應[8]。內服的抗組胺藥物如抗組胺H1和H2受體拮抗劑等，常有不同程度的副反應，包括嗜睡、眩暈、口干及胃腸道不適等。大多數止癢藥物單獨應用時療效往往不夠理想，藥物的聯用可能會引起其他更嚴重的不良反應[9]。黃桷蘭（Michelia alba DC），又稱白蘭花，含有氧代黃心樹寧堿，柳葉木蘭堿，白蘭花堿，黃心樹寧堿等成分，其新鮮花瓣含0.7%揮發油，油中主要成分為芳樟醇、甲基丁香油酚和苯乙醇[10-11]。研究表明，黃桷蘭的部分成分如芳樟醇具有抗炎作用[12]，但黃桷蘭在民間作為止癢的偏方的作用[10]還尚未證實。因此，研究價廉易得的天然植物黃桷蘭的止癢作用及其機理，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡的昆明小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供[SCXK（渝）2012-001]。

磷酸組胺（上海源葉生物科技有限公司）； 皮炎平（華潤三九醫藥股份有限公司）；IL-6 ELISA小鼠血清檢測試劑盒96T（韻博生物科技有限公司）；黃桷蘭鮮花（重慶醫科大學創新實驗室提供）；黃桷蘭乙醇溶液儲備液（0.5 g/mL）（由100 g新鮮黃桷蘭花溶于200 mL無水乙醇中制成）；1 g/mL的黃桷蘭乙醇溶液（由黃桷蘭乙醇溶液儲備液蒸餾水5倍稀釋而成）；0.02 g/mL的黃桷蘭乙醇溶液（由0.1 g/mL的黃桷蘭乙醇溶液蒸餾水5倍稀釋而成）；Bouin氏固定液（由5 mL冰醋酸、25 mL甲醛溶液和75 mL飽和苦味酸水溶液配置成）；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 健康成年昆明小鼠60只，雌雄各半，根據體質量隨機分組，每組10只。分為黃桷蘭乙醇溶液高、中、低三個濃度組，模型組，生理鹽水組，陽性藥物（皮炎平）組。

1.2.2 建立瘙癢模型 用脫毛劑（硫化鋇和滑石粉按3∶7比例混合后由蒸餾水配置而成）脫去小鼠耳后毛發，面積為1.5 cm×2.0 cm，并用紗布蘸蒸餾水清潔、擦干。40 min后，分別在6組小鼠的去毛部位皮下注射0.05%磷酸組胺溶液0.1 mL。

1.2.3 給藥 用醫用棉簽連續兩次于注射部位涂抹給藥，每次給藥量為2 mL。黃桷蘭乙醇溶液高劑量組、中劑量組、低劑量組給藥濃度分別為0.5 g/mL、0.1 g/mL、0.02 g/mL；模型組未給予任何處理；生理鹽水組給予0.9%氯化鈉；陽性藥物組涂抹0.25 g皮炎平膏劑。

1.2.4 小鼠搔抓行為的觀察 注射組胺后立即將小鼠放入自制觀察籠（30 cm×30 cm×45 cm，由6個小格組成）。觀察小鼠從注射組胺開始到出現第一次搔抓反應的時間即潛伏期，隨后用攝像機拍攝小鼠30 min內活動情況。依據錄像回放，由經過培訓的人員進行搔抓次數統計。1次搔抓是小鼠四肢對耳后涂藥部位的1次或連續多次搔抓。

1.2.5 血清IL-6的檢測 小鼠的搔抓次數記錄結束后立即斷頭取血1 mL，靜置至血液分層后以3 500 r/min的速度離心10 min制備血清，放置于-20 ℃的冰箱保存，30 d后用ELISA試劑盒測定各組小鼠血清中IL-6的濃度。

1.2.6 HE染色 斷頭取血后取注射部位周圍皮膚切成小塊（面積為1 cm×1 cm）置于Bouin氏固定液（由5 mL冰醋酸、25 mL甲醛溶液和75 mL飽和苦味酸水溶液配置成）中保存1周，1周后做石蠟切片，然后對石蠟切片進行HE染色，觀察并比較各處理組之間的皮膚中炎癥細胞的數量及形態差異。

1.3 統計學分析

用SPSS 20.0 進行統計分析。血清中IL-6的濃度服從正態分布，采用均值和標準差表示數據的集中趨勢和離散程度，用方差分析對其進行檢驗；搔抓潛伏期、搔抓次數及炎癥細胞數量不服從正態分布，采用中位數和四分位間距表達數據的集中趨勢和離散程度，用秩和檢驗對其進行分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學結果

2.1.1 搔抓潛伏期 各組小鼠在給予相應的藥物處理后，小鼠無明顯的行為學改變，偶有梳理毛發和對面部、腹部等處的搔抓行為，潛伏期過后開始出現搔抓反應。其中模型組潛伏期最短，黃桷蘭乙醇溶液低劑量組潛伏期最長。對搔抓潛伏期進行正態性檢驗，P=0.00<0.05，潛伏期不服從正態分布。故采用隨機區組資料秩和檢驗對潛伏期進行分析，？字2=6.020，P=0.304>0.05，故差異無統計學意義。各組搔抓潛伏期如表1所示。

2.1.2 搔抓次數 各組30 min搔抓次數如表2所示，在所記錄到的搔抓反應中，搔抓主要集中在注射處及其附近的皮膚。對搔抓次數進行正態性檢驗，P=0.031<0.05，搔抓次數不服從正態分布。故采用隨機區組資料秩和檢驗對搔抓次數進行分析，？字2=32.971，P=0.00<0.05，故總體差異有統計學意義。多重比較結果如表3所示，在搔抓高峰時，其他各組的搔抓次數明顯小于模型組（P<0.05）；陽性對照組搔抓次數明顯低于高劑量組、中劑量組、低劑量組、生理鹽水組（P<0.05）；高劑量組搔抓次數高于低劑量組、生理鹽水組，差異具有統計學意義（P<0.05）；生理鹽水組和中劑量組、低劑量組的差異無統計學意義（P>0.05），說明中劑量和低劑量組的效果與生理鹽水類似；隨著注射黃桷蘭乙醇溶液濃度的遞減，搔抓次數依次減少。

2.2 HE染色結果

2.2.1 黃桷蘭乙醇溶液對瘙癢小鼠血清IL-6的影響 對血清中IL-6的濃度進行正態性檢驗，P=0.569>0.05，服從正態分布。故采用隨機區組資料方差分析對血清中IL-6的濃度進行分析，F=1.507，P=0.148>0.05，故差異無統計學意義。結果見表4。

2.2.2 HE染色鏡下觀察結果 病理切片用HE染色后 （圖1），可觀察到細胞核大而圓、染色較深的炎癥細胞，對炎癥細胞數進行正態性檢驗，P=0.04<0.05，炎癥細胞數不服從正態分布。故采用隨機區組資料秩和檢驗對炎癥細胞數進行分析，？字2=6.971，P=0.223>0.05，故差異無統計學意義。炎癥細胞觀察結果如表5所示。

3 討論

瘙癢是皮膚科最常見的癥狀之一，是一種能引起搔抓欲望的不愉快感覺。蚊蟲叮咬所致的瘙癢是最常見的一種皮膚源性瘙癢。當蚊子叮咬人類時，會從口器注入唾液。其唾液含有蟻酸（HCOOH）、抗凝血劑及目前成分不明的蛋白質等很多外來物質。引起身體的免疫系統會釋放出一種稱為組織胺的蛋白質，組胺引起被“咬”部位周圍血管擴張，形成小紅疹。組胺可促進多種細胞和組織合成及分泌interleukin-1A（IL-1A），interleukin-1B（IL-1B），interleukin-6（IL-6），interleukin-8（IL-8）或RANTES等促炎細胞因子及趨化因子， 促進過敏-炎癥反應[13]，引起瘙癢。組胺還會刺激皮膚中的神經末梢，直接引起瘙癢并且釋放P物質（SP），SP又會促肥大細胞脫顆粒釋放組胺進一步引起瘙癢[14]。同時，瘙癢引起的搔抓可導致炎性介質的釋放，加大瘙癢的嚴重程度，從而形成瘙癢-搔抓的惡性循環[15]。

蟲咬性皮炎的發生主要是由于蚊蟲叮咬后體內組胺物質的升高導致的，因此本次實驗用組胺建立瘙癢模型，進而模擬蟲咬性皮炎在體內的發生機制。本實驗通過在小鼠耳后皮內注射0.05%的磷酸組胺溶液成功建立瘙癢模型。在組胺注射部位涂抹藥物，觀察不同處理組小鼠的搔抓潛伏期以及30 min內的搔抓次數，用ELISA法測定小鼠血清中IL-6濃度，取耳后的皮膚組織制作病理切片，觀察組織中炎癥細胞的浸潤增生程度。

從行為學結果來看，黃桷蘭乙醇溶液對小鼠的搔抓反應有一定的抑制作用。我們發現注射低劑量的黃桷蘭乙醇溶液的小鼠搔抓次數與涂抹生理鹽水的相近，且都低于其他各組，因此低劑量的黃桷蘭乙醇溶液的止癢效果較好。血清ELISA檢測的結果表明黃桷蘭乙醇溶液會降低瘙癢發生后小鼠血清內的IL-6濃度，但結果沒有統計學意義，分析其原因可能是樣本量較小。病理切片的結果表明黃桷蘭乙醇溶液可以減少瘙癢模型小鼠體內的炎癥細胞的浸潤和增生，且結果表明濃度越高其作用效果越好。這和血清學和行為學上的結果有一定的差異，可能由于高劑量組的濃度過高，對小鼠皮膚產生一定的脂溶性，造成損傷，進而導致病理學結果和血清學、行為學的結果不一致。

綜上所述，黃桷蘭乙醇溶液對蟲咬皮炎引起的瘙癢有一定的抑制作用，且低劑量溶液止癢效果較好。本研究表明黃桷蘭乙醇溶液的止癢機制可能是其葉中的揮發性油性成分抑制炎癥細胞的浸潤和增生，減少炎癥介質的釋放來止癢的，但還需要更進一步的實驗來驗證該假設。

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