小兒柴桂退熱顆粒的UPLC指紋圖譜及聚類(lèi)、主成分分析

林源 陳敏

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1；R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）04-0474-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.04.11

摘 要 目的：建立小兒柴桂退熱顆粒的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行聚類(lèi)分析與主成分分析。方法：采用UPLC法，色譜柱為 Waters Acquity UPLC BEH C18，流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為0.5 ?L。以葛根素為參照，測(cè)定14批小兒柴桂退熱顆粒樣品的UPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)14批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析與主成分分析。結(jié)果：14批樣品的UPLC圖譜有15個(gè)共有峰，相似度均>0.90；經(jīng)驗(yàn)證，14批樣品UPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。14批樣品可聚為兩大類(lèi)。結(jié)論：所建指紋圖譜可為小兒柴桂退熱顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞 小兒柴桂退熱顆粒；超高效液相色譜；指紋圖譜；聚類(lèi)分析；主成分分析；質(zhì)量控制

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish UPLC fingerprint of Xiaoer chaigui tuire granules， and to conduct cluster analysis （CA） and principal component analysis （PCA）. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters Acquity UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.05% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.5 mL/min. The detection wavelength was 260 nm， the column temperature was 40 ℃， and sample size was 0.5 ?L. Using puerarin as reference， UPLC fingerprints of 14 batches of Xiaoer chaigui tuire granules were determined. The similarity of 14 batches of samples was evaluated by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition）， and common peak was identified. CA and PCA were conducted by using SPSS 19.0 software. RESULTS： There were 15 common peaks in UPLC chromatograms of 14 batches of samples. The similarity of UPLC fingerprints of 14 batches of samples was higher than 0.90， and UPLC fingerprint was in good agreement with control fingerprint. The 14 batches of samples could be clustered into 2 categories. CONCLUSIONS： Established fingerprint can provide reference for quality evaluation of Xiaoer chaigui tuire granules.

KEYWORDS Xiaoer chaigui tuire granules； UPLC； Fingerprint； Cluster analysis； Principal component analysis； Quality control

小兒柴桂退熱顆粒由柴胡、桂枝、葛根、黃芩、浮萍、白芍、蟬蛻等7味中藥組合而成，具有發(fā)汗解表、清里退熱之功效，常用于小兒外感發(fā)熱，癥見(jiàn)發(fā)熱、頭身痛、流涕、口渴、咽紅、溲黃、便干等[1]。臨床上，該藥經(jīng)常聯(lián)合利巴韋林、阿莫西林、頭孢克肟等化學(xué)藥治療小兒上呼吸道感染、手足口病等[2-4]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）對(duì)小兒柴桂退熱顆粒的質(zhì)量控制僅規(guī)定了薄層色譜鑒別和葛根素含量測(cè)定，但其作為復(fù)方制劑，現(xiàn)行《中國(guó)藥典》所采用的質(zhì)量檢測(cè)方法有較大局限性，難以全面地評(píng)價(jià)質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)是表征中藥所含成分與其質(zhì)量的一種有效方法，是目前中藥及中藥制劑質(zhì)量控制的有效手段[5-9]。超高效液相色譜法（UPLC）相比傳統(tǒng)高效液相色譜法（HPLC），具有分析速度快、分離度好、靈敏度高等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、藥品分析等領(lǐng)域[10-12]。因此，筆者采用UPLC法建立小兒柴桂退熱顆粒指紋圖譜，結(jié)合聚類(lèi)分析與主成分分析，以期為其質(zhì)量控制及快速評(píng)價(jià)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Nexera UHPLC System 型超快速UPLC儀，包括SPD-M20A型光電二極管陣列檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；KQ-3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MILLI-Q型超純水儀（德國(guó)Merck公司）。

1.2 藥品與試劑

小兒柴桂退熱顆粒（編號(hào)：S1～S14）均購(gòu)自本地藥店，其中編號(hào)S1～S7為貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：20141144、20151016、20151221、20151225、20160624、20160922、20161112，規(guī)格：4 g/袋；編號(hào)S8～S14為葵花藥業(yè)集團(tuán)（襄陽(yáng)）隆中有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：150711、151017、151220、160718、160924、161009、161201，規(guī)格：5 g/袋；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 ?m）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（其洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：0.5 ?L。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品適量，置于研缽中研成細(xì)粉，混勻，稱(chēng)取上述細(xì)粉1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，稱(chēng)定質(zhì)量，加70%甲醇溶液50 mL，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，以葛根素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD<2.0%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以葛根素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD<2.0%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取樣品（編號(hào)：S1）適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以葛根素峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD<2.0%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 UPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 指紋圖譜的生成 取14批樣品各適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)14批樣品的UPLC圖譜進(jìn)行分析，得UPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)14批樣品的UPLC圖譜進(jìn)行比較分析，詳見(jiàn)表2。結(jié)果，14批樣品UPLC圖譜的相似度均>0.90，表明各樣品間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

2.4.3 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 對(duì)圖2進(jìn)行分析，結(jié)果，共確定15個(gè)共有峰，其總面積占色譜峰總面積的87.85%，具有較大代表性。3號(hào)峰（葛根素）的色譜峰分離良好，峰面積較大，在圖譜中較穩(wěn)定，因此確定3號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其他峰相對(duì)于3號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見(jiàn)表3、表4。

2.5 聚類(lèi)分析與主成分分析

2.5.1 聚類(lèi)分析 以各共有峰相對(duì)峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以歐氏距離平方為區(qū)間進(jìn)行聚類(lèi)，詳見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，14批樣品可聚為兩大類(lèi)： S8、S10、S11、S13、S14為第1類(lèi)；S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S9、S12為第2類(lèi)。第1類(lèi)全部為葵花藥業(yè)集團(tuán)（襄陽(yáng)）隆中有限公司產(chǎn)品；第2類(lèi)除S9、S12外，均為貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司產(chǎn)品，說(shuō)明同一廠(chǎng)家產(chǎn)品質(zhì)量具有較高的穩(wěn)定性。

2.5.2 樣品共有峰主成分分析 以共有峰的峰面積為變量，將14批樣品15個(gè)共有峰數(shù)據(jù)（14×15）標(biāo)準(zhǔn)化后導(dǎo)入SPSS 19.0軟件進(jìn)行因子分析。根據(jù)主成分特征值和貢獻(xiàn)率，提取了2個(gè)主成分因子（A1、A2），其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)87.806%。其中，A1特征值為11.188，貢獻(xiàn)率為74.588%；A2特征值為1.983，貢獻(xiàn)率為13.217%。旋轉(zhuǎn)后的主成分因子載荷矩陣見(jiàn)表5。

表5中每一個(gè)載荷量表示主成分與對(duì)應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)，經(jīng)計(jì)算可得主成分的模型為：F1=0.264 6X1+0.255 6X2+0.282 2X3+0.273 3X4+0.282 5X5+0.289 4X6+0.292 1X7+0.291 2X8+0.278 3X9+0.295 4X10+0.121 1X11+0.294 2X12+0.290 6X13+0.012 3X14-0.161 7X15。F2=0.125 7X1+0.242 2X2+0.205 2X3-0.088 1 X4+0.110 8X5+0.087 3X6+0.044 0X7-0.114 3X8-0.019 2 X9-0.031 2X10-0.424 7X11-0.027 7X12-0.044 7X13+0.612 8X14+0.529 8X15。公式中F1、F2分別表示2個(gè)主成分，X1、X2……X15分別表示經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的共有峰的相對(duì)峰面積。2個(gè)主成分中，F(xiàn)1特征值最大，所含信息最多，而A1中系數(shù)較大的為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X12、X13，表明共有峰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13在小兒柴桂退熱顆粒質(zhì)量控制中起著較重要作用，為重點(diǎn)控制成分。

3 討論

本研究組考察流動(dòng)相時(shí)，選用了甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，以甲醇-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，各待測(cè)成分峰基本達(dá)到基線(xiàn)分離，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象。

進(jìn)樣分析后，筆者在210～400 nm條件下進(jìn)行供試品溶液全波長(zhǎng)掃描，對(duì)比不同波長(zhǎng)下各成分的響應(yīng)值。結(jié)果表明，各色譜峰在260 nm波長(zhǎng)附近響應(yīng)值均較高，各主要色譜峰響應(yīng)值均較大，且分離度良好。

研究過(guò)程中，筆者比較了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液（100%、90%、70%、50%、30%）和水提取的效果。結(jié)果，以70%甲醇溶液提取時(shí)，效果最好，各待測(cè)成分提取率高，提取液易于濾過(guò)。同時(shí)，筆者比較了超聲提取和加熱回流提取兩種提取方法的差異。結(jié)果，超聲提取相比加熱回流的提取率略低，但超聲提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便，故采用超聲提取法。

中藥復(fù)方制劑通常由多種中藥材組合而成，所含化學(xué)成分較為復(fù)雜，本研究前期采用HPLC法，結(jié)果顯示各主要色譜峰達(dá)到較好分離度的分析時(shí)間需要90 min左右。通過(guò)對(duì)比HPLC法與UPLC法發(fā)現(xiàn)，在各主要色譜峰實(shí)現(xiàn)同等分離度條件下，UPLC法可顯著縮短分析時(shí)間，提高工作效率，并節(jié)省溶劑，故采用UPLC法進(jìn)行測(cè)定。

綜上所述，所建指紋圖譜可為小兒柴桂退熱顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

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（收稿日期：2017-05-09 修回日期：2017-08-15）

（編輯：張 靜）