豚鼠經典眨眼條件反射雙任務模型的建立

尚經軒 虞 璟 隋建峰 范 蕊 虞樂華 (重慶醫科大學附屬第二醫院康復理療中心，重慶 40000)

豚鼠經典眨眼條件反射雙任務模型的建立

尚經軒1虞 璟2隋建峰3范 蕊 虞樂華 (重慶醫科大學附屬第二醫院康復理療中心，重慶 400010)

目的 在同一豚鼠體上建立痕跡性和延遲性眨眼條件反射雙任務模型，為研究認知過程中前額葉與其他腦區信息編碼機制提供模型。方法 以經典的眨眼條件反射為基礎，采用1 kHz和3 kHz正弦波純音分別配對壓強為20 kPa的束狀氧氣流對豚鼠左側眼角膜進行刺激，利用肌肉張力換能器采集豚鼠眨眼活動，用眨眼條件反射行為特征傳感器信號分析軟件V2.2版分析眨眼數據。結果 經過10 d的配對訓練后，6只豚鼠均建立了痕跡性和延遲性眨眼條件反射雙任務。實驗發現，與痕跡性眨眼條件反射相比，豚鼠更容易建立延遲性眨眼條件反射。結論 利用同一豚鼠首次成功建立了痕跡性和延遲性眨眼條件反射雙行為模型。

痕跡性眨眼條件反射;延遲性眨眼條件反射;雙任務模型

經典眨眼條件反射(EBC)一直是研究聯合型學習記憶神經生物學機制的重要模型〔1，2〕。其基本訓練過程是：條件刺激(CS，如聲音或光)與非條件刺激(US，如向角膜吹氣或眶周電擊)反復配對呈現，訓練動物學會對條件刺激產生行為條件反應(CR)。根據該反射訓練時條件刺激與非條件刺激之間的時間關系的不同，EBC又分為延遲性眨眼條件反射(DEBC)和痕跡性眨眼條件反射(TEBC)。所謂DEBC是指：條件刺激的起點與非條件刺激的起點有一定時間間隔，即US在CS出現之后延遲一定時間才出現，但與CS同時終止;與DEBC相比，TEBC的最大不同點是CS的終點與US的起點之間有段無任何刺激的時間間隔。前額葉在眨眼條件反射中的作用成為研究的熱點，需要建立TEBC和DEBC模型，分析在學習與記憶中前額葉與其他結構的作用關系〔3〕。目前有學者利用豚鼠成功建立了聽覺識別訓練模型，采用CS與US配對分別刺激兩組豚鼠成功建立TEBC和DEBC，但實驗結果往往會受動物狀態等因素的干擾〔4，5〕。因此，在同一豚鼠體上建立 TEBC和 DEBC雙任務模型，對于應用EBC準確分析前額葉在認知過程中的作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康8～10周齡雄性英國種白化豚鼠6只，350～450 g/只，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，飼養于溫度為20℃ ～25℃的動物室內，24 h循環燈照，自由進食、飲水，并適當給予維生素C補充。在飼養籠內鋪以木屑，以保持環境干燥。實驗在上午9：00～下午5：00進行。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠頭部小型頭顱固定裝置的安裝 用1%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g，腹腔注射)和速眠新Ⅱ(0.1 ml，肌肉注射)復合麻醉動物，并將其頭部固定于腦立體定向儀上(SR-6N，Narishige，Japan)。常規消毒后，沿顱骨中線切開皮膚和皮下組織，切開范圍為眼后至耳間的區域。在暴露的顱骨上鉆開4個直徑約1.0 mm的小孔(坐標：孔1和2：前囟后2.0 mm，雙側旁開2.0 mm;孔3和4：前囟后12.0 mm，雙側旁開2.0 mm)。分別用4顆已消毒的不銹鋼螺絲釘(直徑：1.0 mm，螺距：400 μm，重量：0.3 g)反旋入1～4號小孔內。將矩形頭部固定支架(大小：1.0 cm×1.0 cm×0.4 cm;材料：有機玻璃，重量：0.5 g)嵌合在1～4孔不銹鋼螺絲之間，后用502強力膠拌牙科水泥固定。術后給予必要的抗感染措施。恢復1 w后，全身和眨眼狀況恢復良好的動物進行行為訓練。

1.2.2 行為訓練方法 行為訓練在隔光、隔音的屏蔽柜內進行，保持實驗環境處于安靜狀態。完整的訓練周期包括2 d適應期和10 d訓練期。適應期內，豚鼠被放置于有機玻璃制成的長方體固定盒(20 cm×8 cm×5 cm)中，通過固定盒前端孔洞將其頭頸部露在盒外，使用耳桿頂住頭顱固定支架，將豚鼠頭部固定在腦立體定位儀上。適應時間約50 min，在此期間不給動物施予任何刺激。

行為訓練在適應期結束后第1天開始，每天每只訓練一次，連續進行10 d，豚鼠固定方法同適應期。將氣流噴嘴放置于正對豚鼠左側眼角膜的位置，距離1.0 cm。非條件刺激(US)為一個持續100 ms、壓強為20 kPa的束狀氧氣流;條件刺激(CS)為持續500 ms的1kHz低頻聲和持續300 ms的3 kHz高頻聲組成的正弦波純音(聲壓強度：80～90 dB;升降時間：5 ms)。高頻聲(H-CS)70次，H-CS約占刺激總數的50%左右，低頻聲(L-CS)次數隨機。高、低頻聲隨機出現，由靜電揚聲器播放，并可觸發“SBO-1條件反射與識別學習行為自動訓練系統”，按照設定的參數釋放氧氣流，具體的訓練流程見圖1。

圖1 雙任務訓練流程示意圖

DEBC配對訓練時，低頻聲CS開始400 ms后，對左眼角膜施予US，CS和US同時結束;而在TEBC配對訓練時高頻聲CS開始600 ms后，對左眼角膜施予US。每只動物每天訓練1次，每次配對訓練間隔時間為15～30 s(平均為20 s)。

1.2.3 眼輪匝肌活動記錄 訓練時，末端帶有尼龍細線的蛙心夾夾住豚鼠左側上眼瞼，尼龍細線另一端連接肌肉張力換能器。眨眼活動引起的張力變化轉換為電位波動，可以反映左側上眼瞼的活動情況(1 mV電位波動與0.25 mm眨眼幅度變化對應)。眨眼活動信號、CS信號由多通道電生理信號記錄儀同步記錄，采樣頻率為20 kHz，數字信號存儲于控制的電腦中。

1.2.4 數據分析 使用眨眼條件反射行為特征傳感器信號分析軟件V2.2版分析存儲于電腦中的眨眼數字信號。顯著的眨眼活動滿足以下2個標準：①上眼瞼活動值(時刻t)≥眼瞼活動基線值+1 mV;②滿足條件①的時間總和超過15 ms。眨眼反應參數定義：條件性眨眼反應(CR)：在DEBC配對訓練模式中CS開始后200～400 ms階段發生的顯著眨眼活動;在TEBC配對訓練模式中CS開始后400～600 ms階段發生的顯著眨眼活動。驚愕反應(SR)為由于聲音而產生的驚愕反應，其定義為CS開始后35～100 ms階段發生的顯著眨眼活動。非條件眨眼反應(UR)定義為US開始后1～100 ms發生的顯著眨眼活動。眨眼反應參數定義如下：①CR峰幅度：CR最大值與基線值之間的幅度間隔;②SR峰幅度：SR最大值與基線值之間的幅度間隔。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 豚鼠痕跡性和延遲性眨眼條件反射建立過程中眨眼反射圖像

痕跡性和延遲性眨眼條件反射建立過程中第1天的圖像對比：TEBC和DEBC都沒有建立，而在TEBC訓練任務中SR反應的峰幅度較高。見圖2。

痕跡性和延遲性眨眼條件反射建立過程中第10天的圖像對比：TEBC和DEBC習得率和峰幅度保持在高水平，建立了TEBC和DEBC;而在TEBC中SR出現率及峰幅度與DEBC的相比，始終保持在高水平。見圖3。

圖2 第1天TEBC和DEBC訓練

圖3 在第10天TEBC和DEBC訓練

2.2 痕跡性和延遲性眨眼條件反射建立過程中各項參數的動態變化

2.2.1 CR習得率 在痕跡性眨眼條件反射訓練的第1～10天，CR習得率隨訓練天數的增加而逐漸增加，訓練第10天CR習得率〔(84.87±4.09)%〕顯著高于訓練的第一天〔(5.55±2.89)%〕(P＜0.05);同樣，在延遲性眨眼條件反射訓練的第1～10天，CR習得率隨訓練天數的增加而逐漸增加，訓練第10天CR習得率〔(91.77±1.18)%〕顯著高于訓練的第1天〔(7.25±2.32)%〕(P＜0.05)。DEBC習得率顯著高于TEBC習得率(P＜0.05)。見圖4。

圖4TEBC和DEBC CR習得率動態變化

2.2.2 CR峰幅度 在痕跡性眨眼條件反射訓練的第1～10天，CR峰幅度隨訓練天數的增加而逐漸升高，訓練第10天CR峰幅度〔(3.08±0.25)mV〕顯著高于訓練第一天的峰幅度〔(1.23±0.45)mV〕(P＜0.05);同樣，在延遲性眨眼條件反射訓練的第1～10天，CR峰幅度隨訓練天數的增加而逐漸升高，訓練第10天CR峰幅度〔(3.20±0.30)mV〕顯著高于訓練第一天的峰幅度〔(1.60±0.38)mV〕(P＜0.05)。TEBC和DEBC的峰幅度比較差異無統計學意義(P=0.638)。見圖5。

圖5TEBC和DEBC CR峰幅度動態變化

2.2.3 SR出現率 在痕跡性眨眼條件反射訓練的第1～10天，SR出現率差異無統計學意義(P=0.334);在延遲性眨眼條件反射建立過程中，SR出現率也無統計學意義(P=0.352)。TEBC中SR的出現率顯著高于DEBC(P＜0.05)。見圖6。

2.2.4 SR峰幅度 在痕跡性眨眼條件反射訓練的第1～10天，SR峰幅度差異無統計學意義(P=0.841);同樣，在延遲性眨眼條件反射訓練的第1～10天，SR峰幅度差異無統計學意義(P=0.891)。TEBC中SR的峰幅度顯著高于DEBC(P＜0.05)。見圖7。

圖6 TEBC和DEBC SR出現率動態變化

圖7TEBC和DEBC中SR峰幅度動態變化

3 討論

為了闡明學習與記憶發生的神經機制、信息編碼過程，需要動物行為實驗模型來研究這一腦認知功能過程〔6〕。有文獻報道，DEBC建立依賴于小腦結構，TEBC的建立還需要其他結構(海馬、前額葉等)參與〔7〕。

與大鼠相比，豚鼠性情溫順，便于使用頭顱固定眨眼訓練裝置，無刺激時幾乎沒有自主眨眼，本實驗前期已成功建立了豚鼠經典眨眼條件反射模型〔5〕。因此，本實驗采用豚鼠，意在同一動物體上建立痕跡性和延遲性眨眼條件反射雙任務模型，為探索前額葉在學習與記憶中神經元活動信息編碼機制提供有用的動物模型。目前，尚未見相關研究報道。

本研究結果顯示：①經過連續10 d的CS與US配對訓練，每只豚鼠均可以習得TEBC和DEBC，且兩組CR習得率隨著訓練天數的增加而增加;但它們更容易習得DEBC，表現在其有較高的CR習得率和較快的習得速度，這與在大鼠、小鼠以及人等受試動物上的發現相似，也與利用豚鼠進行TEBC、DEBC單任務訓練結果一致〔6〕。②在TEBC和DEBC訓練中兩組CR的峰幅度隨著訓練天數的增加而上升，但TEBC和DEBC的CR峰幅度差異不顯著。③在TEBC和DEBC雙任務建立中，SR發生率及峰幅度存在差異，表現在TEBC的SR發生率及峰幅度都高于DEBC的發生率和峰幅度，提示SR和CR可能是由不同神經環路或神經機制介導的。更復雜的纖維輸入方式和途徑可能是建立TEBC所需要的訓練次數要多于DEBC的原因〔3～7〕。

在同一豚鼠體上建立TEBC和DEBC雙任務模型很好地消除了實驗動物的影響，準確地反映出動物對訓練任務的學習情況;同時，進行兩種訓練任務也節省了訓練時間，減少了實驗對動物的需要量。總之，同一豚鼠體上可以建立TEBC和DEBC雙任務模型。

1 Nokia MS，Penttonen M，Korhonen T，et al.Hippocampal theta(3 ～8 Hz)activity during classical eyeblink conditioning in rabbits〔J〕.Neurobiol Learn Mem，2008;90(1)：62-70.

2 Linden DJ.Neuroscience.From molecules to memory in the cerebellum〔J〕.Science，2003;301(5640)：1682-5.

3 Kalmbach BE，Tatsuya O，Joy C，et al.Interactions between prefrontal cortex and cerebellum revealed by trace eyelid conditioning〔J〕.Learn Mem，2009;16(1)：86-95.

4 黃率帥，林 曦，胡 波，等.經典眨眼條件反射建立后豚鼠小腦齒狀-中位核突觸超微結構的變化〔J〕.第三軍醫大學學報，2009;31(6)：477-9.

5 陳 浩，胡 波，楊 麗，等.延遲性和痕跡性條件反射建立過程中豚鼠眨眼反應特征參數的變化〔J〕.第三軍醫大學學報，2010;32(2)：95-8.

6 Shors TJ.Memory traces of trace memories：neurogenesis，synaptogenesis and awareness〔J〕.Trends Neurosci，2004;27(5)：250-6.

7 Woodruff-Pak DS，Disterhoft JF.Where is the trace in trace conditioning〔J〕?Trends Neurosci，2008;31(2)：105-12.

Establishment of a dual task model of classical eyeblink conditioning in guinea pigs

SHANG Jing-Xuan，YU Jing，SUI Jian-Feng，et al.
Center of Physical Medicine and Rehabilitation，Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China

Objective To establish a dual task model of trace and delay eyeblink conditioning in the same guinea pigs，which offering a model for the relationship study of the frontal cortex and other brain regions in cognitive process.Methods On the basis of the classical eyeblink conditioning，1 kHz and 3 kHz tone conditioned stimulus(CS)were separately paired with a 20 kPa corneal oxygen-puff unconditioned stimulus(US)to stimulate the left cornea of the guinea pigs.Blink activity in guinea pig was collected with muscle tension transducer，and eyeblink conditioning behavior feature sensor signal analyzing software V2.2 was used to analyze the data of eyeblink.Results After 10 days'paring training，all 6 guinea pigs had established the dual task model of trace and delay eyeblink conditioning.Compared to trace eyeblink conditioning，it was easier for the guinea pigs to establish delay eyeblink conditioning.Conclusions It is first reported that the same guinea pigs could also obtain trace and delay eyeblink conditioning，which provides a reliable model for studying the exact role of prefrontal cortex in the cognitive processes.

Trace eyeblink conditioning;Delay eyeblink conditioning;Dual task model

R338.61

〕 A

1005-9202(2012)22-4925-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.034

國家自然科學基金資助項目(No.30771769)

1 重慶城市管理職業學院 2 重慶醫科大學臨床學院

3 第三軍醫大學基礎醫學部生理學教研室

虞樂華(1963-)，男，主任醫師，教授，博士，主要從事物理醫學與康復科學的研究。

尚經軒(1977-)，男，講師，碩士，主要從事物理醫學與康復科學的研究。

〔2011-10-10收稿 2011-12-12修回〕

(編輯 曲 莉)