逆流法提取百香果果皮中總黃酮的工藝研究

廖蘭 吳俊良

摘要：為優(yōu)化逆流法提取百香果果皮中總黃酮的提取工藝，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)化逆流提取法.結(jié)果表明逆流法最優(yōu)提取工藝條件為：干燥的百香果果皮粉末進行逆流提取，提取級數(shù)3級，料液比1：60，提取時間45 min，提取溫度55℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在此工藝條件下總黃酮提取率為2.18%，提取率高于常規(guī)熱回流法、索氏提取法和超聲波輔助提取法。

關(guān)鍵詞：百香果；逆流提取；總黃酮

0引言

百香果（Passiflora edulis）又稱西番蓮、巴西果、雞蛋果，在廣西區(qū)內(nèi)大量栽培，百香果果皮是其果汁加工的主要副產(chǎn)物.研究證明百香果果實中，果皮占鮮重的50%～55%，其中含有豐富的碳水化合物、多糖、黃酮和多酚類物質(zhì)，豐富的生物活性成分使其具有抗炎、抗焦慮和鎮(zhèn)靜功能、抗成癮功能、抗氧化等作用，Reza等證實百香果果皮中的黃酮能抑制炎癥因子的釋放，可緩解炎癥.Maria等證實百香果外殼的乙醇提取物對中性粒細(xì)胞活性氧化物和髓過氧化酶的抑制作用強于漿果中的提取物。

國內(nèi)對百香果果皮的研究主要是利用果皮制作果醬與果脯、提取果膠，或者是對百香果果皮的化學(xué)成分進行分析，而對果皮中總黃酮提取工藝的研究鮮有報道.黃酮類物質(zhì)的提取方法有熱回流法、索氏提取器提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、逆流提取法等，逆流提取方法可確保藥材與溶劑之間始終保持較大的有效成分濃度差，提高提取效率，節(jié)省溶劑用量，從而降低后續(xù)操作的能耗，本試驗采用逆流提取法提取百香果果皮中的總黃酮，通過正交試驗優(yōu)選出最佳工藝方案，并與其他提取方法比較，以期為百香果的綜合利用提供一種可行的方法。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

百香果，購于柳州市，用前經(jīng)粉碎過100目（150μm）篩，60℃干燥保存?zhèn)溆?

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，生化試劑，上海金穗生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；752N紫外分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CW-2000超聲一微波協(xié)同萃取反應(yīng)儀：上海新拓分析儀器科技有限公司。

1.2方法

1.2.1三級逆流提取

精密稱取1.00 g干燥的百香果果皮粉末置于圓底燒瓶中，加入60mL的70%乙醇溶液，60℃下提取40 min，按照三級逆流提取流程進行提取，提取流程如圖1所示.提取完后趁熱減壓抽濾得供試樣品溶液備用。

1.2.2常規(guī)熱回流提取

精密稱取1.00 g干燥的百香果果皮粉末置于圓底燒瓶中，加入60mL的70%乙醇溶液，60℃下提取2 h.提取完后趁熱減壓抽濾，得供試樣品溶液備用。

1.2.3索氏提取器提取

精密稱取1.00 g干燥的百香果果皮粉末置于索氏提取器中，加入60mL的70%乙醇溶液，60℃下提取2 h.提取完后趁熱減壓抽濾，得供試樣品溶液備用。

1.2.4超聲波輔助提取

精密稱取1.00g干燥的百香果果皮粉末置于圓底燒瓶中，加入60mL的70%乙醇溶液，超聲功率為300 w、60℃條件下提取2 h.提取完后趁熱減壓抽濾，得供試樣品溶液備用。

1.2.5逆流提取工藝條件的優(yōu)化

1）提取級數(shù)的確定：精密稱取1.00 g百香果果皮粉末置于圓底燒瓶中，加入60mL的70%乙醇溶液，60℃下提取40min，提取級數(shù)分別為1、2、3、4、5級，加熱回流提取.提取完后趁熱減壓抽濾，得供試樣品溶液備用。

2）單因素試驗：逆流提取法的主要影響因素有提取時間、乙醇濃度、料液比和提取溫度.在逆流提取級數(shù)為3級的條件下，分別研究提取時間為20min、30min、40min、50min、60min，乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%，料液比為1：40、1：50、1：60、1：70、1：80，提取溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的不同條件下單因素提取工藝。

3）正交試驗：在提取級數(shù)確定的基礎(chǔ)上，考察提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）對總黃酮提取率的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，按照正交表L（3）進行正交試驗.試驗的因素水平表見表1。

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及供試品總黃酮含量的測定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用適量的50%乙醇溶解，移至50 mL容量瓶中，定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的蘆丁對照品溶液.精密量取0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL至10mL具塞比色管中，用50%乙醇定容至5mL，精密加入5%的NaNO₂溶液0.3mL，搖勻放置6min后，精密加入10%的Al（N0₃），溶液0.3mL，搖勻放置6min后，精密加入4%的NaOH溶液4.0 mL，用50%的乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置15min后，以不加蘆丁溶液的第一管為空白對照，在510nm處測定吸光度，以吸光度y為縱坐標(biāo)，蘆丁含量x（mg/mL）為橫坐標(biāo)，做回歸處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程：y=9.8767x+0.0283，其相關(guān)系數(shù)R²=0.998 4，表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～0.06 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2）供試樣品的制備：將提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下濃縮并回收乙醇，濃縮液用50%乙醇溶液定容至100mL備用。

3）總黃酮含量測定：分別精密吸取不同提取液的供試樣品溶液2.0mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，測定吸光度，根據(jù)下式計算總黃酮提取率：式中，c為總黃酮的濃度（mg/mL）；w為供試樣品溶液體積（mL）；為百香果果皮干粉質(zhì)量（g）.

1.2.7方法學(xué)考查

1）精密度試驗：精密吸取蘆丁對照品溶液2.0 mL，置于10 mL具塞試管中，按照1.2.6項操作，重復(fù)測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。

2）重復(fù)性試驗：采用三級逆流提取方法制備供試品溶液6份，按照1.2.6項操作，計算RSD值.

3）穩(wěn)定性試驗：精密吸取供試品溶液2.0 mL，按照1.2.6項操作，每隔10min測定吸光度，持續(xù)測定60 rain，計算RSD值。

4）加樣回收率試驗：量取已知總黃酮含量的百香果果皮提取液6份，分別精密加入相當(dāng)于溶液中總黃酮含有量80%、100%及120%的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按1.2.6項操作測定其吸光度，并計算加樣回收率及RSD值.

1.2.8驗證試驗

按照最優(yōu)逆流提取方案平行制備5份提取液，按照1.2.6項操作測定吸光度，并計算總黃酮的平均提取率及RSD值。

2結(jié)果與討論

2.1方法學(xué)考查

精密度試驗測得RSD值為1.09%，表明儀器的精密度良好.重復(fù)性試驗測得RSD值為0.325%，表明試驗重復(fù)性良好.穩(wěn)定性試驗測得RSD值為2.13%，表明供試品溶液在60rain內(nèi)基本穩(wěn)定，加樣回收率測得平均回收率為97.68%，RSD值為2.54%，表明試驗回收率高、準(zhǔn)確度高。

2.2不同提取方法提取白香果果皮中總黃酮

對常規(guī)熱回流法、索氏提取法、超聲波法和三級逆流提取法的提取效果和效率進行了比較，結(jié)果表明在相同的提取條件下，三級逆流提取的總黃酮提取率較高.結(jié)果如表2所示。

2.3逆流提取級數(shù)對提取率的影響

不同逆流提取級數(shù)對總黃酮提取率的影響見表3.結(jié)果表明，總黃酮的提取率隨著提取級數(shù)的增大而提高，當(dāng)提取級數(shù)超過3級后提取率上升不明顯，說明百香果果皮中的總黃酮提取已趨于飽和，但提取級數(shù)的增加將大大提高提取過程的動力消耗，故確定逆流提取的級數(shù)為3級。

2.4單因素試驗結(jié)果

2.4.1提取時間對提取率的影響

結(jié)果見圖2.由圖可知，總黃酮提取率隨著提取時間的增加而增加，當(dāng)提取時間為40 min時達(dá)到最大值，說明樣品中的總黃酮基本提取完全.隨后隨著提取時間的延長，樣品中其他醇溶性物質(zhì)被浸提出來，導(dǎo)致總黃酮提取率下降.因此選取40min作為最佳提取時間。

2.4.2料液比提取率的影響

結(jié)果見圖3.由圖可知，總黃酮的提取率隨著料液比的增加而增大，當(dāng)料液比達(dá)到1：60后提取率基本保持不變.這是因為隨著提取溶劑用量的增加，增大了百香果果皮中黃酮類物質(zhì)與溶劑兩相界面的濃度差，從而提高了傳質(zhì)速率使總黃酮提取率上升.但當(dāng)溶劑用量增大到一定程度后，物料中的總黃酮大部分已被提取出來，此時料液比對提取率的影響不明顯.從節(jié)能降耗的角度考慮，適宜選用的料液比為1：60。

2.4.3提取溫度對提取率的影響

結(jié)果見圖4.由圖可知，總黃酮的提取率隨著提取溫度升高而升高，并在60℃時達(dá)到最大值，隨后提取率開始趨于平緩且呈下降趨勢，這是因為隨著溫度增加，乙醇逐漸接近沸點，揮發(fā)速度加快，使乙醇溶液濃度下降，不利于黃酮類物質(zhì)的溶出，而且隨著溫度升高，果膠等一些物質(zhì)的溶出量也會增加.故選擇60℃作為最佳提取溫度。

2.4.4乙醇濃度對提取率的影響

結(jié)果見圖5.由圖可知，總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加而增加，但乙醇超過70%后提取率開始下降，這可能是因為一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性成分的溶出量增大了，故選擇70%乙醇作為最佳提取濃度.由于乙醇濃度在60%、70%、80%條件下得到的總黃酮提取率試驗結(jié)果較為接近，試驗偏差為0.09，考慮到逆流提取工藝流程在實驗室操作的復(fù)雜性，故只選取提取時間、料液比和提取溫度作為正交試驗的考察因素。

2.5正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，通過L（3）正交表進行正交試驗設(shè)計，以探明提取時間、料液比、提取溫度對提取率的主次關(guān)系，并對其進行極差分析，以確定三級逆流最佳提取工藝，結(jié)果見表4。

由表4分析結(jié)果可知，因素主次為A（提取時間）>B（料液比）>C（提取溫度），最佳工藝條件為A₃B₂C₁D₃，即：提取時間45 min、料液比1：60、提取溫度55℃

2.6驗證試驗結(jié)果

分別在最佳工藝條件下，進行5次三級逆流提取平行試驗，試驗結(jié)果見表5.5次驗證試驗總黃酮提取率的平均值為2.18%，說明試驗重現(xiàn)性好，提取的工藝方案穩(wěn)定可行。

3結(jié)論

本試驗以總黃酮的提取率為考查指標(biāo)，通過單因素預(yù)試驗和正交試驗對逆流法提取百香果果皮中總黃酮的工藝進行研究，結(jié)果表明提取的最佳工藝條件為：逆流提取級數(shù)為3級，料液比1：60，提取時間45 min，提取溫度55℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%.在該工藝方案下總黃酮的平均提取率為2.18%，RSD值為1.39%.三級逆流提取方法與熱回流提取法、索氏提取器提取法、超聲波輔助提取法相比較，在相同的工藝條件下總黃酮的提取率更高，表明逆流提取方法使百香果果皮與提取劑之間始終保持較大的有效成分濃度差，減少了濾渣中溶質(zhì)殘留，可有效提高提取過程的效率。

精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗、回收率試驗和驗證試驗結(jié)果表明，三級逆流提取工藝重復(fù)性好、回收率高，工藝方案穩(wěn)定可行。