紅米花色苷的制備及對膽固醇消化吸收的影響

玉萬國 陳云芳 黎華圣 王梓成 盧玉雙 唐小楊

摘要：為了改善高膽固醇血癥，對紅米麩皮中花色苷進(jìn)行優(yōu)化提取，通過篩選大孔樹脂獲得花色苷富集工藝條件，并研究紅米花色苷對膽固醇消化吸收的影響.實驗結(jié)果顯示，紅米花色苷提取最優(yōu)條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、pH值0.5、溫度40℃、料液比1：10、提取時間2.5 h、提取次數(shù)3次.大孔樹脂HPD100對花色苷具有較高的吸附和解吸率，最佳富集工藝：上樣體積140mL、溫度25℃、吸附1.5h、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、流速1.0mL/min、洗脫體積20mL紅米花色苷主要成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷（cy-3-G），經(jīng)大孔樹脂富集處理，Cy-3-G含量達(dá)36.48%.紅米花色苷對胰脂肪酶具有抑制作用，Cy-3-G含量越高，抑制作用越強(qiáng).紅米水提取物、乙醇提取物、大孔樹脂富集物對胰脂肪酶活力抑制的IC50分別為61.13 mg/L、30.11 mg/L、18.91 mg/L.紅米花色苷具有降低膽固醇微團(tuán)溶解度的作用，cy-3-G含量越高，降低膽固醇溶解作用越強(qiáng).研究表明，紅米及其花色苷是通過抑制胰脂肪酶活性和降低膽固醇微團(tuán)溶解度起到調(diào)節(jié)血脂的作用。

關(guān)鍵詞：紅米；花色苷；大孔樹脂；胰脂肪酶；膽固醇微團(tuán)溶解度

0引言

高膽固醇血癥是嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病之一，是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要誘因，降低機(jī)體膽固醇含量是首選治療方式，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)展中國家患高膽固醇血癥的人口呈現(xiàn)年輕化和快速遞增趨勢，通過輔助飲食手段是降低其高發(fā)率的有效途徑.紅米（Red rice）是一種藥食兩用的大米，紅米稻占我國有色稻米種植資源的第二位，中醫(yī)將紅米譽為“藥米”，具有滋陰補腎、健脾消食、生氣血、清肝明目等功效，紅米營養(yǎng)價值高，口感軟彈，富含花色苷、多酚、黃酮、生物堿和皂苷等活性物質(zhì)，據(jù)文獻(xiàn)報道，紅米具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗炎、抗動脈粥樣硬化和抗衰老等功效，紅米中的有效成分主要來源于麩皮，其中花色苷含量豐富，主要組分為矢車菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-G）、芍藥素-3-葡萄糖苷和二甲花翠素，是潛在的調(diào)節(jié)血脂物質(zhì)。

國內(nèi)外研究主要聚焦紅米的營養(yǎng)功效和抗氧化活性，尚缺乏紅米對膽固醇消化吸收的研究報道.本研究優(yōu)化了紅米花色苷的制備提取條件，篩選了富集純化花色苷的大孔樹脂，采用體外胰脂肪酶抑制模型和膽汁酸微團(tuán)溶解模型，分別探究紅米花色苷提取物對胰脂肪酶活力和膽固醇在膽汁酸微團(tuán)中溶解度的影響，為紅米資源的綜合深加工開發(fā)利用提供理論和實驗支持。

1材料與方法

1.1材料與儀器

紅米：山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院；Cy-3-G、4-甲基傘形酮油酸酯：Sigma公司；胰脂肪酶、磷脂酰膽堿、牛磺膽酸鈉、熒光標(biāo)記膽固醇：生工生物科技有限公司；大孔樹脂：寶恩化工有限公司；甲醇和乙腈（HPLC級）：Tedia公司；乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

碾米機(jī)：長沙昌百世機(jī)械有限公司；電子天平、酸度計：梅特勒一托利多儀器有限公司；UV1800紫外可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；恒溫磁力攪拌器：常州朗越儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海精科儀器有限公司；熒光酶標(biāo)儀：BioTek公司；高效液相色譜儀：Agilent 1260；色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18，5μm，4.6 mmX250 mm。

1.2紅米水提取物和乙醇提取物的制備

1.2.1紅米水提取物的制備

使用碾米機(jī)蛻皮得紅米麩皮，粉碎過60目（250μm）篩，準(zhǔn)確稱取50.0 g，加入500 mL去離子水，調(diào)pH值至0.5，40℃條件下提取3 h，濃縮，冷凍干燥，避光保存。

1.2.2紅米乙醇提取物的優(yōu)化制備

準(zhǔn)確稱取1.0 g紅米麩皮，分別按照不同料液比（1：2、1：5、1：10、1：15、1：20）加入系列乙醇體積分?jǐn)?shù)（55%、65%、75%、85%、95%），調(diào)節(jié)不同pH值（0.25、0.5、1、2、3），在不同溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）條件下提取不同時間（1.5 h、2h、2.5 h、3 h、3.5 h），檢測不同提取次數(shù)（1次、2次、3次、4次、5次）后所得提取液的吸光度值，計算提取率。

1.2.3總花色苷含量的測定（pH示差法）

1.3紅米大孔樹脂提取物的制備

1.3.1篩選大孔樹脂

采用靜態(tài)吸附法，綜合考察大孔樹脂HPD80、HPD100、D101、HZ806、HZ816、S8和AB8對紅米花色苷的吸附/解吸容量和解吸率，篩選最優(yōu)大孔樹脂.準(zhǔn)確稱取0.1 g各種干樹脂，加入10 mL上述紅米乙醇提取物，在30℃和150r/min條件下吸附24h，測定吸附量.用去離子水沖洗飽和樹脂，加入10mL乙醇溶液（75%，pH值0.5），在30℃和150 r/min條件下解吸24 h，測定解吸量，計算解吸率。

1.3.2樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

準(zhǔn)確稱取0.1g干重的最優(yōu)大孔樹脂，加入10 mL上述紅米乙醇提取物，在30℃和150 r/min條件下吸附不同時間（0min、20min、40min、60min、90min、120min、180min、240min、300min），繪制樹脂吸附動力學(xué)曲線。

1.3.3樹脂靜態(tài)吸附等溫曲線

準(zhǔn)確稱取0.1g干重的最優(yōu)大孔樹脂，加入10 mL不同濃度（0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12mg/mL、0.16 mg/mL）上述紅米乙醇提取物，分別在不同溫度（25℃、30℃、35℃）和150 r/min條件下吸附3 h，繪制樹脂吸附等溫曲線。

1.3.4乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸的影響

準(zhǔn)確稱取0.1g干重的最優(yōu)大孔樹脂，加入10 mL上述紅米乙醇提取物，在30 ℃和150 r/main條件下吸附2.5h，用去離子水沖洗至洗液無色，分別加入不同體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）乙醇溶液，在30℃和150 r/min條件下解吸3 h，測定解吸量，計算解吸率。

1.3.5樹脂動態(tài)穿流曲線和洗脫曲線

準(zhǔn)確稱取10.0g濕重的最優(yōu)大孔樹脂，填入15mmx400mm玻璃層析柱，柱床體積15 mL，柱床高度12 cm，在流速1.0mL/min的條件下，加入上述紅米乙醇提取物，繪制穿流曲線，測定最優(yōu)上樣體積，采用最優(yōu)上樣體積對樹脂進(jìn)行飽和吸附，用30mL去離子水沖洗，使用乙醇體積分?jǐn)?shù)80%繪制洗脫曲線。

1.3.6 HPLC檢測Cy-3-G含量

流動相：A（0.01 mol/L磷酸緩沖液），B（乙腈：0.01 mol/L磷酸緩沖液=8：2），流速：1.0mL/min，溫度：30℃，進(jìn)樣量：20μL，線性梯度洗脫30min，檢測波長：520nm。

1.4紅米花色苷對膽固醇消化吸收的影響

1.4.1紅米花色苷抑制胰脂肪酶試驗

取20μL鹽酸緩沖液（pH值8.0），加入5μL供試樣品和25μL胰脂肪酶（0.5 mg/mL）溶液，在37℃條件下孵育10min后，加入50μL4-甲基傘形酮油酸酯（100μmol/L），在37℃條件下反應(yīng)30min，測定熒光值（激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長460 nm），計算抑制率。

1.4.2紅米花色苷降低膽固醇微團(tuán)溶解度試驗

取180μL熒光標(biāo)記膽固醇溶液（熒光標(biāo)記膽固醇0.5 mmol/L，磷脂酰膽堿0.6 mmol/L，牛磺膽酸鈉6.6 mmol/L，氯化鈉132 mmol/L），加入20μL供試樣品，在37℃條件下孵育30 min，13 000 r/min離心20min，取上清液，測定熒光值（激發(fā)波長462 nm，發(fā)射波長536 nm），計算膽固醇微團(tuán)溶解度降低率。

2結(jié)果與討論

2.1優(yōu)化紅米花色苷制備提取條件

如圖1所示，為紅米花色苷制備提取的單因素實驗結(jié)果.由圖1（a）可見，提取紅米麩皮中花色苷的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%.依據(jù)“相似相溶”原則，75%乙醇的極性與紅米花色苷的極性相似，因此提取率最高.由圖1（b）可見，當(dāng)pH值為0.5時，紅米花色苷提取率最高，表明酸性條件可以保持花色苷的穩(wěn)定性，減少分解.由圖1（c）可見，提取溫度為40℃時，紅米花色苷提取率最高.當(dāng)提取溫度從30℃升至40℃時，花色苷穩(wěn)定，未分解，提取率線性升高.當(dāng)提取溫度高于40℃時，花色苷穩(wěn)定性差，發(fā)生分解，是提取率降低的原因，由圖1（d）可見，當(dāng)提取時間為2.5 h時，紅米花色苷提取率最高.在提取時間增至2.5 h時，提取率呈線性升高，但當(dāng)提取時長超過2.5 h后，提取率反而下降，表明花色苷穩(wěn)定性差，已發(fā)生分解，由圖1（e）可見，當(dāng)料液比從1：2降至1：10時，紅米花色苷提取率線性升高，雖然料液比繼續(xù)降至1：20時，提取率略有上升，但與料液比1：10的提取率沒有顯著差異，基于節(jié)能環(huán)保的考量，選擇1：10為最佳料液比.由圖1（f）可見，提取次數(shù)增加至3次時，紅米花色苷提取率最高，當(dāng)提取次數(shù)大于3次時，花色苷穩(wěn)定性差，發(fā)生分解，提取率略有下降。

2.2建立紅米花色苷大孔樹脂富集提取工藝

2.2.1大孔樹脂篩選

如圖2所示，為7種大孔樹脂對紅米花色苷的吸附量、解吸量和解吸率.樹脂的吸附和解吸能力是篩選樹脂的重要指標(biāo).由圖2可見，大孔樹脂HPD100對紅米乙醇提取物的吸附量為（49.11±3.12）mg/g，解吸量為（33.86±1.96）mg/g，解吸率為（67.35±1.89）%.與其余大孔樹脂相比較，同時具備較好的吸附和解吸率，因此選取苯乙烯型非極性大孔樹脂HPD100作為紅米花色苷的富集樹脂。

2.2.2 HPD100大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)研究

如圖3所示，為HPD100大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線和靜態(tài)吸附等溫曲線.由圖3（a）靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線可見，在0-20 min時，HPD100大孔樹脂對紅米花色苷的吸附量呈線性升高，吸附速率大.在20-60 min時，吸附速率逐漸降低，90 min時達(dá)到吸附平衡.由圖3（b）靜態(tài)吸附等溫曲線可見，HPD100大孔樹脂吸附能力隨著紅米花色苷乙醇提取物濃度的增大而增強(qiáng)，但隨著溫度的升高而減弱，表明HPD100大孔樹脂靜態(tài)吸附可能是放熱過程。

2.2.3 HPD100大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸動力學(xué)研究

如圖4所示，為HPD100大孔樹脂動態(tài)穿流曲線與動態(tài)洗脫曲線.由圖4（a）動態(tài)穿流曲線可見，當(dāng)上樣體積小于120mL時，HPD100大孔樹脂完全吸附紅米花色苷乙醇提取物.上樣體積大于120mL時，穿流率呈線性升高，至上樣體積360 mL時，穿流率達(dá)100%，因此，選取穿流率小于10%的上樣體積140 mL由圖4（b）可見，HPD100大孔樹脂解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高，80%以上乙醇體積分?jǐn)?shù)的解吸率無顯著差異，基于節(jié)能環(huán)保的考量，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)80%為洗脫劑.由圖4（c）動態(tài)洗脫曲線可見，當(dāng)洗脫劑乙醇體積小于10mL時，花色苷含量較低.當(dāng)洗脫劑乙醇體積從10 mL增加至30 mL時，花色苷含量較高.當(dāng)洗脫劑乙醇體積大于30mL后，花色苷含量趨于零.因此，選擇收集10-30 mL花色苷含量較高的洗脫組分.由表1可知，經(jīng)由HPLC分析檢測，紅米提取物中Cy-3-G的含量分別為：水提取物（2.39±0.21）%、乙醇提取物（8.92±0.78）%、樹脂富集物（36.48±3.11）%。

2.3紅米花色苷對膽固醇消化吸收的影響

2.3.1紅米花色苷對膽固醇消化的影響

如圖5（a）所示，為紅米花色苷對胰脂肪酶活力的抑制曲線.胰脂肪酶能夠?qū)⒏视腿ニ鉃橛坞x脂肪酸，游離脂肪酸、膽固醇與膽汁酸鹽等形成乳糜微團(tuán)，輔助膽固醇消化.降低游離脂肪酸的生成可以減少乳糜微團(tuán)的形成，抑制胰脂肪酶的活力是有效方式，由圖5（a）和表2可知，紅米花色苷提取物對胰脂肪酶均有抑制作用，紅米水提取物、乙醇提取物、大孔樹脂富集物對胰脂肪酶活力抑制的ICso（半數(shù)抑制率）分別為61.13 mg/L、30.11 mg/L、18.91 mg/L.上述結(jié)果結(jié)合表1可知，紅米花色苷提取物對胰脂肪酶抑制作用與Cy-3-G的含量呈正相關(guān)劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.3.2紅米花色苷對膽固醇吸收的影響

如圖5（b）所示，為紅米花色苷影響膽固醇微團(tuán)溶解度的實驗結(jié)果.腸道中的膽固醇需要與游離脂肪酸、膽汁酸鹽等形成乳糜微團(tuán)，才能經(jīng)由小腸細(xì)胞吸收.降低膽固醇在乳糜微團(tuán)中的溶解度，是減少膽固醇吸收的有效途徑.由圖5（b）可知，紅米花色苷提取物均能降低膽固醇微團(tuán)的溶解度.上述結(jié)果結(jié)合表1可知，紅米花色苷提取物降低膽固醇微團(tuán)溶解度的作用與Cy-3-G的含量呈正相關(guān)劑量效應(yīng)關(guān)系.表明紅米可以作為預(yù)防和降低機(jī)體膽固醇水平的藥食兩用資源。

3結(jié)論

通過優(yōu)化紅米花色苷的制備提取條件（乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、pH值0.5、溫度40℃、料液比1：10、提取時間2.5 h、提取次數(shù)3次），建立了HPD100大孔樹脂富集花色苷的最佳工藝（上樣體積140 mL、溫度25℃、吸附1 h、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、流速1.0 mL/min、洗脫體積20 mL）.經(jīng)大孔樹脂富集處理，Cy-3-G含量達(dá)（36.48_+3.11）%.利用體外胰脂肪酶抑制模型和膽汁酸微團(tuán)溶解模型，探討了紅米花色苷對膽固醇消化吸收的影響，結(jié)果表明，紅米花色苷主要成分為Cy-3-G，對胰脂肪酶活力和膽汁酸微團(tuán)溶解度均有抑制作用，抑制作用與Cy-3-G的含量呈正相關(guān)劑量效應(yīng)關(guān)系.紅米水提取物、乙醇提取物、大孔樹脂提取物對胰脂肪酶活力抑制的IC50分別為61.13 mg/L、30.11 mg/L、18.91 mg/L.紅米花色苷影響膽固醇消化吸收和調(diào)節(jié)血脂的作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究。