大蒜素對模型小鼠的抗炎性痛作用及機制研究

任亮 任翔 劉金寶 朱吾元 杜鋼軍

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）18-2479-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.08

摘 要 目的：研究大蒜素對模型小鼠的抗炎性痛作用及機制。方法：50只BALB/c小鼠隨機分為模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、阿司匹林組（200 mg/kg）和大蒜素高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg），每組10只；均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d。末次給藥1 h后給予小鼠腹腔注射0.7%冰醋酸溶液（0.2 mL）建模，記錄建模15 min內(nèi)其扭體反應(yīng)次數(shù)。分組與給藥同上，末次給藥1 h后給予小鼠左后足底皮下注射1.5%甲醛溶液（25 μL）建模，記錄建模后0～10 min（第Ⅰ時相）和10～60 min（第Ⅱ時相）時小鼠累計舔足時間。分組與給藥同上，末次給藥1 h后給予小鼠右耳廓正反兩面均勻涂抹二甲苯（30 μL）建模，建模2 h后測定小鼠耳廓腫脹度，以兩耳質(zhì)量差值為耳廓腫脹度，并計算耳廓腫脹抑制率。50只BALB/c小鼠隨機分為空白對照組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）和大蒜素高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg），每組10只；均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d。末次給藥20 min后給予小鼠足趾皮下注射1%角叉菜膠0.9%氯化鈉溶液（30 μL）建模，分別于建模前及建模1、3、5 h后測定小鼠足趾容積，以建模前后小鼠足趾容積差值為足趾腫脹度；測定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量以及總抗氧化能力（T-AOC）水平；采用Western blot法檢測核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）蛋白表達。結(jié)果：與模型組比較，阿司匹林組和大蒜素高、中劑量組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)均顯著減少；第Ⅰ時相時大蒜素高、中劑量組和第Ⅱ時相時阿司匹林組及大蒜素高、中劑量組小鼠累計舔足時間均顯著縮短；阿司匹林組和大蒜素高劑量組小鼠耳廓腫脹度均顯著降低；建模1、3 h后大蒜素高、中劑量組和建模5 h后大蒜素高劑量組小鼠足趾腫脹度均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與空白對照組比較，模型組小鼠足趾腫脹組織中SOD、GSH-Px活性均顯著減弱，MDA含量顯著增加，T-AOC水平顯著降低，NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表達均顯著增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，大蒜素高劑量組小鼠足趾腫脹組織中SOD、GSH-Px活性均顯著增強，MDA含量顯著減少，且大蒜素高、中劑量組小鼠T-AOC水平均顯著升高，同時大蒜素高劑量組小鼠足趾腫脹組織中NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表達均顯著減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：大蒜素對模型小鼠炎性痛有一定的緩解作用，其機制與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 大蒜素；炎性痛；氧化應(yīng)激；核轉(zhuǎn)錄因子κB；腫瘤壞死因子α；白細胞介素1β

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of anti-inflammatory pain effect of allicin in model mice. METHODS： Totally 50 BALB/c mice were randomly divided into model group （constant volume of 0.9% sodium chloride solution），aspirin group （200 mg/kg），allicin high-dose，medium-dose and low-dose groups （40，20，10 mg/kg），with 10 mice in each group. They were given relevant medicine intragastrically，once a day，for consecutive 3 d. One hour after last medication，they were given intraperitoneal injection of 0.7% glacial acetic acid solution （0.2 mL）； the times of writhing response were recorded with in 15 min after modeling. Grouping and administration were same as above； 1 h after last medication，mice were given subcutaneous injection of 1.5% formaldehyde solution （25 μL） via left back toe； accumulative licking time of mice were recorded 0-10 min （time phaseⅠ） and 10-60 min （time phaseⅡ） after modeling. Grouping and administration were same as above； 1 h after last medication，mice were given xylene （30 μL） on both sides of right ear； the degree of auricular swelling of mice was determined 2 h after modeling. The mass difference of two ears was regarded as the degree of auricular swelling and then the inhibitory rate of swelling was calculated in mice. Totally 50 BALB/c mice were randomly divided into blank control group （constant volume of 0.9% sodium chloride solution），model group （constant volume of 0.9% sodium chloride solution） and allicin high-dose，medium-dose and low-dose groups （40，20，10 mg/kg），with 10 mice in each group. They were given relevant medicine intragastrically，once a day，for consecutive 3 d. Twenty minutes after last medication，mice were given subcutaneous injection of 1% carrageenan 0.9% sodium chloride solution （30 μL） via toe. Toe volume of mice was determined before modeling and 1，3，5 h after modeling. The difference of toe volume in mice was regarded as the degree of toe swelling. The activities of SOD and GSH-Px，contents of MDA，and level of T-AOC were determined. The expression levels of NF-κB，TNF-α and IL-1β protein were detected by Western blotting. RESULTS： Compared with model group，the times of writhing response were decreased significantly in aspirin group，allicin high-dose and medium-dose groups. The licking time of mice was shortened significantly in allicin high-dose and medium-dose group at time phaseⅠ， aspirin group，allicin high-dose and medium-dose at time phase Ⅱ. The degree of auricular swelling was decreased significantly in aspirin group and allicin high-dose group. The degree of paw swelling was decreased significantly in allicin high-dose and medium-dose groups 1，3 h after modeling， in allicin high-dose group 5 h after modeling，with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. Compared with blank control group，the SOD and GSH-Px activities，level of T-AOC in paw swelling tissue of mice were decreased significantly in model group，while MDA content，the protein expression of NF-κB，TNF-α and IL-1β were increased significantly，with statistical significance （P<0.01）. Compared with model group，SOD and GSH-Px activities in paw swelling tissue of mice were increased， while MDA content were decreased of allicin high-dose group and the activity of T-AOC in allicin high-dose and medium-dose groups were increased significantly； the protein expression of NF-κB，TNF-α and IL-1β in paw swelling tissue of mice were decreased significantly in allicin high-dose，and medium-dose groups，with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Allicin has certain anti-inflammatory pain effects，and its mechanism may be related to anti-oxidative stress and inhibition of NF-κB signaling pathway.

KEYWORDS Allicin； Inflammatory pain； Oxidative stress； NF-κB； TNF-α； IL-1β

炎性痛是臨床常見的病理性疼痛，多數(shù)是由于機體受到創(chuàng)傷、感染等損傷導(dǎo)致外周組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時誘發(fā)的疼痛，其中痛覺過敏、痛覺超敏和自發(fā)性疼痛是其主要臨床特征[1-2]。有研究報道，核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號通路是調(diào)控炎性痛的重要信號通路[3]，當(dāng)機體受損或出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)時，炎癥因子[如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）等]大量釋放，從而激活NF-κB信號通路，而活化的NF-κB會進入細胞核，參與和促進炎癥因子的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等一系列過程，使炎癥因子生成進一步增多，從而加重和放大疼痛感受[4]。目前，炎性痛治療藥物主要有解熱鎮(zhèn)痛藥等，但上述藥物對炎性痛的緩解和治療效果并不理想，且存在易成癮、誘發(fā)消化道潰瘍等諸多不良反應(yīng)[5]。

大蒜素是從百合科蔥屬植物大蒜、洋蔥中提取的含硫有機化合物，具有抗菌、抗腫瘤、抗消化性潰瘍、抗氧化應(yīng)激等作用，并且可改善記憶、調(diào)節(jié)免疫、保護缺血心肌等[6]。本研究通過冰醋酸致小鼠扭體模型、甲醛致小鼠足底疼痛模型、二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型及角叉菜膠致小鼠足趾腫脹模型，觀察大蒜素抗炎性痛的作用，并探討其作用機制，以為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AL104型電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）；BW-PVM802型足趾容積測量儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；759S型紫外-可見分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；TGL-16型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；SIM-FI40AY65型制冰機（日本Sanyo公司）；Mimi-PROTEAN? Tetra Cell聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）儀、Mini TBL轉(zhuǎn)移電泳儀、ChemDOCTM XRS凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；XW-80型旋渦混合器（上海楚定分析儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

大蒜素注射液（上海禾豐制藥有限公司，批準文號：國藥準字H31022371，批號：1409151，規(guī)格：2 mL ∶ 30 mg）；阿司匹林片（哈藥集團制藥總廠，批準文號：國藥準字H23021186，批號：1510283，規(guī)格：0.5 g/片）；角叉菜膠（美國Sigma公司，批號：122K14456）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（批號：20151212）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號：20151220）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（批號：20160115）、總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（批號：20151225A）、均購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠NF-κB、TNF-α、IL-1β、β-actin抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（批號：152680）、彩色預(yù)染蛋白Marker（批號：151225）、RIPA組織裂解液、蛋白上樣緩沖液（2×）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（0.45 μm，批號：13B02C22）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光液（批號：151220）均購自武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級BALB/c小鼠，4～6周齡，雌雄兼半，體質(zhì)量18～22 g，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2015-0001]。標準條件飼養(yǎng)1周，自由進食、飲水，環(huán)境溫度（22±2）℃、相對濕度65%～70%，人工黑暗和光照交替。

2 方法

2.1 冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)實驗

50只BALB/c小鼠隨機分為模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、阿司匹林組（200 mg/kg）[7]和大蒜素高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg）[8]，每組10只（雌雄兼半）；灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d。末次給藥1 h后，給予小鼠腹腔注射0.7%冰醋酸溶液（0.2 mL）建模，記錄建模15 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的扭體次數(shù)（腹部內(nèi)陷、軀干和后肢拉伸或臀部抬起等行為改變即為扭體反應(yīng)）。同時計算小鼠扭體反應(yīng)抑制率，扭體反應(yīng)抑制率（%）=（模型組扭體次數(shù)均值-用藥組扭體次數(shù)均值）/模型組扭體次數(shù)均值×100%[9]。

2.2 甲醛致小鼠足底痛實驗

動物分組及給藥同“2.1”項下操作。末次給藥1 h后，給予小鼠左后足底皮下注射1.5%甲醛溶液（25 μL）建模，記錄建模后0～10 min（第Ⅰ時相，早發(fā)相）和>10～60 min（第Ⅱ時相，遲發(fā)相） 兩個時間段小鼠累計舔足時間[9]。

2.3 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗

動物分組及給藥同“2.1”項下操作。末次給藥1 h后，給予小鼠右耳廓正反兩面均勻涂抹二甲苯（30 μL）建模，建模2 h后將小鼠頸椎脫臼處死，剪下雙耳，用7 mm打孔器取下左右耳廓同一部位的耳片并稱定質(zhì)量，兩耳片質(zhì)量差值即代表耳廓腫脹度[9]。同時計算小鼠耳廓腫脹抑制率，耳廓腫脹抑制率（%）=（模型組耳廓腫脹度-用藥組耳廓腫脹度）/模型組耳廓腫脹度×100%[9]。

2.4 角叉菜膠致小鼠足趾腫脹實驗

50只BALB/c小鼠隨機分為空白對照組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）和大蒜素高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg），每組10只（雌雄兼半）；灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d，末次給藥20 min后，給予右后足足趾皮下注射1%角叉菜膠0.9%氯化鈉溶液（30 μL）建模，分別于建模前及建模1、3、5 h后測定小鼠足趾容積，以建模前后小鼠足趾容積差值為足趾腫脹度[9]。按試劑盒說明書操作，測定SOD、GSH-Px活性和MDA含量以及T-AOC水平。采用Western blot法檢測NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表達：頸椎脫臼處死小鼠后迅速取下足趾腫脹組織，并放入盛有適量液氮的研缽中，充分研磨均勻，加入1 mL RIPA裂解液混勻并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中繼續(xù)裂解，30 min后于4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清液即為蛋白提取液；加入等體積蛋白上樣緩沖液（2×）于沸水浴中進行蛋白變性，之后取25 μL進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育等，加超敏ECL化學(xué)發(fā)光液于凝膠成像儀下顯影拍照，以目標蛋白條帶與β-actin條帶灰度值之比進行半定量分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用 x±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大蒜素對模型小鼠扭體反應(yīng)的影響

與模型組比較，阿司匹林組和大蒜素高、中劑量組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；3組小鼠扭體反應(yīng)抑制率分別為74.88%、51.66%、27.01%，詳見表1。

3.2 大蒜素對模型小鼠疼痛反應(yīng)的影響

與模型組比較，第Ⅰ時相時大蒜素高、中劑量組和第Ⅱ時相時阿司匹林組及大蒜素高、中劑量組小鼠累計舔足時間均顯著縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.3 大蒜素對模型小鼠耳廓腫脹的影響

與模型組比較，阿司匹林組和大蒜素高劑量組小鼠耳廓腫脹度均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；2組小鼠耳廓腫脹抑制率分別為62.43%、44.65%，詳見表3。

3.4 大蒜素對角叉菜膠致小鼠足趾腫脹的影響

空白對照組小鼠足趾無腫脹，模型組小鼠足趾腫脹。與模型組比較，建模1、3 h后大蒜素高、中劑量組和建模5 h后大蒜素高劑量組小鼠足趾腫脹度均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.5 大蒜素對模型小鼠足趾腫脹組織中氧化應(yīng)激指標的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠足趾腫脹組織中SOD、GSH-Px活性均顯著減弱，MDA含量顯著增加，T-AOC水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，大蒜素高劑量組小鼠足趾腫脹組織中SOD、GSH-Px活性均顯著增強，MDA含量顯著減少，且大蒜素高、中劑量組小鼠T-AOC水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

3.6 大蒜素對模型小鼠足趾腫脹組織中NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠足趾腫脹組織NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表達均顯著增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，大蒜素高劑量組小鼠足趾腫脹組織中NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表達均顯著減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表6。

4 討論

炎性痛通常是由于創(chuàng)傷、感染導(dǎo)致組織器官出現(xiàn)炎癥性損傷，釋放炎癥因子而引起的疼痛[10]。在研究炎性痛發(fā)病機制和相關(guān)治療藥物篩選工作中，往往需要用多種動物模型進行實驗。本研究發(fā)現(xiàn)，40、20 mg/kg大蒜素可顯著減少冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)和縮短甲醛致小鼠足底疼痛誘導(dǎo)的累計舔足時間，降低角叉菜膠致小鼠足趾腫脹的程度；40 mg/kg大蒜素還能顯著降低二甲苯致小鼠耳廓腫脹的程度。上述結(jié)果提示，大蒜素對炎性痛具有較好的緩解作用。

發(fā)生炎癥反應(yīng)時，損傷組織可產(chǎn)生大量自由基，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等臨床癥狀，因此，抑制機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)可緩解炎性痛[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，40 mg/kg大蒜素可顯著增強模型小鼠足趾腫脹組織中SOD、GSH-Px活性，減少MDA含量，升高T-AOC水平，提示大蒜素可能通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解炎性痛。

炎癥介質(zhì)和細胞因子在炎性痛的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[13-14]。如單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等產(chǎn)生的TNF-α，其不僅具有很強的促炎活性及免疫調(diào)節(jié)作用，還可刺激損傷組織細胞釋放IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等炎癥因子，引起一系列炎癥反應(yīng)并放大和加重這一過程[15]。炎癥早期重要的促炎因子IL-1β 是由巨噬細胞、淋巴細胞分泌的細胞因子，能與TNF-α 共同激活諸多免疫細胞和炎癥細胞，促進炎癥的發(fā)生發(fā)展和調(diào)控、誘導(dǎo)其他炎癥因子的分泌與釋放[16]。NF-κB信號通路與上述炎癥因子的關(guān)系如下：當(dāng)細胞受到炎癥介質(zhì)刺激時，NF-κB信號通路被激活，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進入細胞核，啟動靶基因（TNF-α、IL-6、IL-1β等）轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等炎癥因子持續(xù)或過度表達，使炎性痛持續(xù)發(fā)生或不斷放大[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，40 mg/kg大蒜素可顯著下調(diào)模型小鼠足趾腫脹組織中NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表達，提示大蒜素抗炎性痛機制與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

由于目前尚無作用靶點及效應(yīng)與大蒜素完全一致的藥物作為陽性對照藥物，本研究選擇了抗炎性痛首選藥物阿司匹林作為陽性對照藥物，實驗結(jié)果驗證了大蒜素對炎性痛有較好的緩解作用，而這也表明本研究所用的動物模型是合理的。但在進行相關(guān)機制研究時，考慮到阿司匹林抗炎性痛的作用靶點為環(huán)氧化酶，其機制與大蒜素不一致，所以筆者在參閱了相關(guān)文獻[9]后，未將阿司匹林作為陽性對照藥物納入比較，且在進行NF-κB信號通路檢測時只采用了Western blot法進行初步的數(shù)量研究，希望以上不足能在今后的研究中逐步完善。

綜上所述，大蒜素對模型小鼠炎性痛有一定的緩解作用，其機制與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

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（收稿日期：2017-11-18 修回日期：2018-03-15）

（編輯：張 靜）