XRCC1基因rs25487位點多態性與肺癌發生的相關性分析

沐宇 姬懷雪 胡書群 高杏 杜秀平 何偉平 吳如夢 王艷

中圖分類號 R968；R734.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）12-1648-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.15

摘 要 目的：探討DNA修復基因X線損傷修復交叉互補基因1（XRCC1）rs25487位點多態性與肺癌發生的相關性。方法：選取2015年9月-2016年7月于徐州醫科大學附屬醫院就診的蘇北地區漢族原發性肺癌患者208例，作為肺癌組；選擇同期于該院進行體檢的健康志愿者214例，作為對照組。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法檢測各受試者XRCC1基因rs25487位點的基因型，采用Logistic回歸模型評價各基因型與肺癌發生的相關性。結果：兩組受試者的年齡及性別分布比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；而肺癌組吸煙者的比例顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。共檢出XRCC1基因rs25487位點AA、AG、GG 3種基因型。其中，對照組受試者AA、AG、GG型頻率分別為43.5%、41.1%、15.4%，肺癌組患者上述基因型頻率分別為28.8%、48.6%、22.6%，兩組受試者各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），但其基因型分布組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。與AA型個體比較，AG型個體發生肺癌的風險增加了2.265倍[比值比（OR）=2.265，95%置信區間（CI）（1.299，3.950），P=0.040；經年齡、性別、吸煙史校正的OR=2.309，95%CI（1.274，4.185），P=0.006]，差異有統計學意義；GG型個體發生肺癌的風險增加了1.310倍[OR=1.310，95%CI（0.771，2.228），P=0.318；經校正的OR=1.429，95%CI（0.811，2.518），P=0.217]，但差異無統計學意義。結論：XRCC1基因rs25487位點突變雜合是我國蘇北地區漢族人群發生肺癌的危險因素，且吸煙可以增加肺癌發生的風險。

關鍵詞 XRCC1基因；rs25487位點；單核苷酸多態性；肺癌；發生；相關性

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the correlation of XRCC1 rs25487 polymorphism with the occurrence of lung cancer. METHODS： A total of 208 patients with primary lung cancer of Han nationality in Northern Jiangsu selected from the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University during Sept. 2015-Jul. 2016 were included in lung cancer group. A total of 214 healthy volunteers of the hospital underwent physical examination were included in control group. PCR-RFLP was used to detect the genotypes at XRCC1 rs25487 locus， and Logistic regression model was used to evaluate the correlation of genotypes with the occurrence of lung cancer. RESULTS： There was no statistical significance in the distribution of age and gender between 2 groups （P>0.05）. The proportion of smoker in lung cancer group was significantly higher than control group， with statistical significance （P<0.05）. AA， AG and GG genotypes were detected at rs25487 locus of XRCC1 gene. The frequency of AA， AG and GG genotype were 43.5%， 41.1% and 15.4% in control group and 28.8%， 48.6% and 22.6% in lung cancer group， respectively. The frequencies of genotypes in 2 groups were in line with Hardy-Weinberg equilibrium （P>0.05）， but there was statistical significance in genotype distribution between 2 groups（P<0.05）. Compared with AA genotype， the risk of lung cancer in individuals carrying AG genotype increased by 2.265 fold [OR=2.265， 95%CI（1.299， 3.950），P=0.040； after corrected with gender， age and smoking history OR=2.309，95%CI（1.274，4.185），P=0.006]， with statistical significance. The risk of lung cancer in individuals carrying GG genotype increased by 1.310 fold [OR=1.310，95%CI（0.771，2.228），P=0.318；after corrected OR=1.429，95%CI（0.811，2.518），P=0.217]， without statistical significance. CONCLUSIONS：rs25487 locus mutant heterozy- gosity of XRCC1 gene is risk factor of lung cancer in Han nationality from Northern Jiangsu， and smoking can increase the risk of lung cancer.

KEYWORDS XRCC1 gene； rs25487； Single nucleotide polymorphism； Lung cancer； Occurrence； Relationship

肺癌是我國惡性腫瘤致死的首要原因，暴露環境危險因素與肺癌的發生發展密切相關[1]。但暴露在相同環境中，不同個體發生肺癌的概率仍存在很大差異[2]。相關研究表明，遺傳因素是增加肺癌易感性的重要原因之一[2]。其中，單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是最常見的遺傳學改變，DNA修復基因的SNP可影響個體對肺癌的易感性[3]。肺癌的發生與內、外源性致癌因子引起的DNA損傷密不可分，DNA修復基因的SNP作為個體DNA修復能力（DNA repair capacity，DRC）差異的分子遺傳學基礎，可能是影響肺癌發生風險的重要遺傳因素[4]。X射線損傷修復交叉互補基因1（X-ray repair cross complementing gene 1，XRCC1）是堿基切除修復（Base excision repair，BER）途徑上的關鍵基因，其編碼的蛋白與DNA聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ一起參與BER過程[5]。盡管XRCC1基因rs25487位點是目前研究的熱點，但因研究群體、種族等差異，結論尚存在很大分歧[6-9]。為此，本研究以我國蘇北地區漢族人群為研究對象，探討其XRCC1基因rs25487位點多態性與肺癌發生的相關性，以期為肺癌的預防和早期診斷尋找新的標志物。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

1.1.1 肺癌組 選取2015年9月-2016年7月于徐州醫科大學附屬醫院就診并經病理學檢查確診為原發性肺癌的蘇北地區患者作為肺癌組。納入標準：（1）年齡>18歲；（2）漢族；（3）無血緣關系；（4）經細胞學或組織學檢查確診為肺癌，包括小細胞肺癌與非小細胞肺癌（如肺腺癌、肺鱗癌等）。排除標準：（1）既往有腫瘤史者；（2）曾接受過手術或放化療者；（3）伴有其他嚴重疾病（如糖尿病、無法控制的高血壓以及最近6個月內出現過心力衰竭或心肌梗死等）者。

1.1.2 對照組 選取同期于該院進行體檢的健康志愿者作為對照組。納入標準：（1）體檢結果報告為健康；（2）與肺癌組患者無血緣關系；（3）無腫瘤尤其是肺癌家族史；（4）無明確職業性致癌因素接觸史；（5）年齡、性別與肺癌組患者匹配。

本研究方案經醫院醫學倫理委員會審核通過，所有受試者均知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 資料收集

收集兩組受試者的人口學資料，包括年齡、性別、個人疾病史、家族史、吸煙史等；采集肺癌組患者的病理學信息，包括病理類型、TNM分期、分化、轉移等。

1.3 XRCC1基因rs25487位點多態性分析

所有受試者均抽取外周靜脈血2 mL，采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司]提取DNA，操作方法參照說明書，產物置于-20 ℃冰箱中保存。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法（Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）檢測受試者XRCC1基因rs25487位點的基因型。引物由生工生物工程（上海）有限公司設計并合成，上游引物：5′ -CCAACACCCCCAAGTACAGC-3′ ，下游引物：5′ -TGGAGGAGCAGTTTGTGCAA-3′ 。反應體系：Dream Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各2 μL（1 μmol/L），DNA模板5 μL，加去離子水至25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃再延伸5 min。酶切反應體系：MspⅠ內切酶1 μL（10 U/μL）、10×T Buffer 2 μL、0.1%牛血清蛋白2 μL、PCR產物10.0 μL，加去離子水至20 μL，于37 ℃下消化12 h。取酶切產物10 μg置于2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結果于1600R型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）上觀察，確定各基因型。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。采用擬合優度χ2檢驗分析受試者基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗。建立Logistic回歸模型評價XRCC1基因rs25487位點基因型與肺癌發生的相關性，以經患者年齡、性別、吸煙史校正后的比值比（Odds ratio，OR）和95%置信區間（Confidence interval，CI）表示相對危險度。所有統計學檢驗均為雙側概率檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者一般資料比較

肺癌組共納入患者208例，其中男性129例，女性79例；平均年齡（60.51±8.32）歲；吸煙者116例，非吸煙者92例；腺癌96例，鱗癌86例，診斷不明確的26例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期75例，Ⅲ～Ⅳ期118例，分期不明確的15例。對照組共納入健康志愿者214例，其中男性132例，女性82例；平均年齡（60.01±8.85）歲；吸煙者84例，非吸煙者130例。兩組受試者的年齡及性別分布比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；而肺癌組吸煙者的比例顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），詳見表1。

2.2 基因型分析

2.2.1 酶切結果 按“1.3”項下條件進行試驗，得XRCC1基因rs25487位點PCR擴增產物的大小為408 bp。經MspⅠ酶切后，AA型的酶切片段大小為408 bp，AG型的酶切片段大小為408、258、150 bp，GG型的酶切片段大小為258、150 bp，詳見圖1。

2.2.2 XRCC1基因型分布情況 共檢出XRCC1基因rs25487位點3種基因型：AA、AG、GG型。其中，對照組受試者AA、AG、GG型頻率分別為43.5%、41.1%、15.4%，肺癌組患者AA、AG、GG型頻率分別為28.8%、48.6%、22.6%。兩組受試者各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）；但其基因型分布組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 XRCC1基因rs25487位點多態性與肺癌發生的相關性

Logistic回歸模型分析結果顯示，與XRCC1基因AA型個體比較，AG型個體發生肺癌的風險增加了2.265倍[OR=2.265，95%CI（1.299，3.950），P=0.040；經校正的OR=2.309，95%CI（1.274，4.185），P=0.006]，差異有統計學意義；GG型個體發生肺癌的風險增加了1.310倍[OR=1.310，95%CI（0.771，2.228），P=0.318；經校正的OR=1.429，95%CI（0.811，2.518），P=0.217]，但差異無統計學意義，詳見表3。

3 討論

DNA修復基因的SNP影響DNA的修復能力，是肺癌遺傳易感性的重要因素[3]。XRCC1基因定位于人類染色體19q13.2～13.3，包含17個外顯子，大小為33 kb。該基因編碼的XRCC1蛋白包含633個氨基酸，沒有已知的酶活性，但作為腳手架蛋白，可與DNA聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ一起參與DNA修復[5]。若個體XRCC1基因突變，可能會導致DNA修復功能的喪失[8-10]。目前，已發現與肺癌易感性相關的3個XRCC1基因SNP位點，分別為密碼子194（C26304T，第6外顯子，Arg194Trp）、密碼子280（G27466A，第9外顯子，Arg280His）和密碼子399（G28152A，第10外顯子，Arg399Gln，rs25487），且多集中在rs25487位點[8，10-11]。盡管國內外有很多研究表明，XRCC1基因rs25487位點多態性與肺癌易感性相關，但結果并不一致：Du Y等[8]的研究結果顯示，XRCC1基因rs25487位點堿基突變可增加個體罹患肺癌的風險（P<0.05）；Natukula K等[11]報道，在印度人群中，攜帶XRCC1基因突變雜合型和突變純合型的個體罹患肺癌的概率顯著增加（P<0.05）；然而，Qian B等[12]在我國天津地區受試人群中并未發現XRCC1基因rs25487位點多態性與肺癌易感性相關（P>0.05）。這提示，受試人群所在區域、環境及種族的差異均有可能對研究結果造成影響，故尋找本地區肺癌易感人群遺傳標志物至關重要。

本研究結果顯示，XRCC1基因rs25487位點突變雜合（AG）型是肺癌發生的風險基因型，攜帶該基因型的個體發生肺癌的風險顯著升高。上述結果提示，XRCC1基因突變與肺癌發生的風險密切相關。XRCC1基因突變可導致基因序列的改變，從而影響其編碼蛋白的合成，在一定程度上抑制了BER過程，最終致使個體罹患肺癌的概率增加[13-14]。但本研究尚未發現GG（突變純合）型與肺癌易感性相關，這可能與XRCC1基因rs25487位點GG型在該地區人群中的分布偏少，且本研究樣本總量也偏小等因素有關，故此結論有待擴大樣本量進一步予以驗證。此外，研究過程中還發現，肺癌組吸煙者的比例顯著高于對照組，提示吸煙是誘發肺癌的重要危險因素。

綜上，XRCC1基因rs25487位點突變雜合與我國蘇北地區漢族人群肺癌的發生密切相關，此基因可作為肺癌預防和早期診斷的標志物。此外，吸煙亦可增加個體罹患肺癌的風險，環境-基因交互作用對肺癌的影響不能忽視。但鑒于本研究樣本量偏小，本課題組將擴大樣本量對上述結果進行證實，并進一步在細胞水平揭示XRCC1基因突變對其編碼蛋白功能的影響及其機制。

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（收稿日期：2017-07-26 修回日期：2018-04-10）

（編輯：張元媛）