HPLC法測(cè)定腎樂(lè)膠囊中阿魏酸含量

王歡歡，黃曉舞（解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 100853）

腎樂(lè)膠囊是解放軍總醫(yī)院非標(biāo)準(zhǔn)制劑品種，由水蛭、當(dāng)歸、黨參等五味中藥組成，具有活血化瘀，益氣養(yǎng)血，健脾利濕的功效。用于慢性腎小球腎炎或伴腎功能不全早、中期，證屬氣虛血瘀兼水濕者，癥見(jiàn)神疲乏力，腰酸腰痛，面色無(wú)華或晦暗，面浮肢腫，納呆，舌質(zhì)淡暗或有瘀點(diǎn)瘀斑，苔薄白或膩，脈沉細(xì)或細(xì)弱。該藥在臨床應(yīng)用多年，質(zhì)量可靠，療效顯著。腎樂(lè)膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)間較早，要求比較低，為了更好的控制其內(nèi)在質(zhì)量，有必要對(duì)原有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高。本研究采用HPLC法對(duì)腎樂(lè)膠囊中阿魏酸含量進(jìn)行測(cè)定，旨在更好的控制腎樂(lè)膠囊的質(zhì)量。

1 儀器與材料

XS105型電子天平（梅特勒精密儀器有限公司）；Agilent 1260液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）； KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；列孔型電熱恒溫水浴鍋（天津市中環(huán)科技開(kāi)發(fā)公司）。

腎樂(lè)膠囊（解放軍總醫(yī)院自制，批號(hào)：SL170501、SL170502、SL170503）；阿魏酸對(duì)照品（含量按99.0%計(jì)，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110773-201614）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法

2.1 色譜條件[1-3]

色譜柱：Agilent EclipseXDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%醋酸水溶液（3 : 7）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：313 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)應(yīng)不低于1500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取阿魏酸對(duì)照品13.10 mg（批號(hào)：110773-201614，含量按99.0%計(jì)），置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL的棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含12.97 μg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取不含黨參、陳皮和當(dāng)歸藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，供試品中阿魏酸與對(duì)照品在相同保留時(shí)間處有相同色譜峰，峰形良好，與其他組分峰基線分離度較好，且陰性樣品無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取貯備液適量，分別加甲醇稀釋配成不同濃度對(duì)照品溶液。分別精密量取貯備液和不同濃度對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得阿魏酸線性回歸方程：y=899395.323x+ 40187.336（r= 0.9999）。結(jié)果表明：阿魏酸的濃度在2.5938 μg·mL-1～ 64.8450 μg·mL-1范圍內(nèi)峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取阿魏酸對(duì)照品溶液（濃度為12.97 μg·mL-1）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，阿魏酸峰面積RSD為0.62%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取批號(hào)SL170501供試品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果表明阿魏酸含量平均值為0.0480 mg·粒-1，RSD為1.58%（n= 6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度實(shí)驗(yàn)

取本品（批號(hào)：SL170501）細(xì)粉適量，在不同時(shí)間，由不同的實(shí)驗(yàn)人員，使用不同的儀器（Agilent 1200液相色譜儀），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果表明，含量測(cè)定中間精密度實(shí)驗(yàn)阿魏酸平均含量為0.0480 mg·粒-1，RSD為1.15%（n=12），表明該方法測(cè)定本品含量中間精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖A – 阿魏酸對(duì)照品；B – 供試品；C – 陰性樣品；1 – 阿魏酸Fig 1 HPLC chromatograms A – ferulic acid control; B – test sample; C – negative reference substance; 1 – ferulic acid

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取本品（批號(hào)：SL170501，含量：0.0480 mg·粒-1）細(xì)粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入濃度為10.4049 μg·mL-1的阿魏酸對(duì)照品溶液（阿魏酸對(duì)照品批號(hào)：110773-201614，含量按99.0%計(jì)）5 mL，再精密加入甲醇20 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，平行制備6份供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，室溫放置，分別于0、4.0、7.5、11.0、15.5、20.5、26.0、35.0 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，供試品中阿魏酸峰面積RSD為1.24%（n= 8），表明供試品溶液室溫放置35 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果. n = 6Tab 1 Results of recovery test. n = 6

2.10 含量測(cè)定

取三批中試樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果. n = 3Tab 2 Results of contents determination of samples. n = 3

3 討論

3.1 專(zhuān)屬性考察

在含量測(cè)定專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)中，取缺當(dāng)歸的陰性樣品，結(jié)果陰性樣品溶液的色譜圖中在與對(duì)照品溶液色譜圖中相應(yīng)的位置有相同的色譜峰出現(xiàn)，表明陰性樣品干擾本品阿魏酸的測(cè)定。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[1,4]，處方中黨參、陳皮藥材中也含有阿魏酸，為進(jìn)一步確定干擾來(lái)源，分別取當(dāng)歸、黨參、陳皮和茯苓藥材細(xì)粉各約1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，照供試品處理方法依法制備供試品溶液，與對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，茯苓中不含阿魏酸，當(dāng)歸、黨參和陳皮中均含有阿魏酸，故將標(biāo)準(zhǔn)修訂為測(cè)定黨參、陳皮和當(dāng)歸中總阿魏酸含量。

3.2 提取方法和時(shí)間考察

在含量測(cè)定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，供試品采用乙酸乙酯超聲提取時(shí)，樣品結(jié)塊，分散不均勻，影響本品含量的準(zhǔn)確測(cè)定，故在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對(duì)供試品的處理方法進(jìn)行篩選，優(yōu)化，使本品含量能準(zhǔn)確測(cè)定。比較了不同提取溶劑[5-8]（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和95%乙醇）對(duì)樣品含量的影響，結(jié)果除采用乙醇提取，供試品溶液色譜圖中主峰前延，影響含量準(zhǔn)確測(cè)定，其它溶劑供試品色譜圖中，主峰峰形良好，且與相鄰雜質(zhì)峰分離度符合要求，不干擾本品含量測(cè)定，且甲醇提取時(shí)，樣品在提取過(guò)程中不結(jié)塊，分散均勻，能將供試品中阿魏酸提取完全，故確定本品的提取溶劑為甲醇。同時(shí)考察了不同提取時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲40 min時(shí)，本品中阿魏酸能提取完全，故確定本品提取時(shí)間為40 min。

3.3 系統(tǒng)耐用性考察

為了考察微小變動(dòng)因素對(duì)本品含量測(cè)定的影響，調(diào)節(jié)流速（0.9、1.0、1.1 mL·min-1）、柱溫（25、30、35 ℃）和流動(dòng)相比例（30 : 70、33 : 67、27 : 73）進(jìn)行試驗(yàn)，含量分別為：0.0477 mg·粒-1、0.0483 mg·粒-1、0.0475 mg·粒-1、0.0491 mg·粒-1、0.0477 mg·粒-1、0.0482 mg·粒-1、0.0470 mg·粒-1（RSD為1.41%，n= 7），結(jié)果表明在測(cè)試條件有微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果基本不受影響，此測(cè)試條件的耐用性良好。

3.4 含量限度考察

根據(jù)以上含量測(cè)定數(shù)據(jù)，結(jié)合大生產(chǎn)工藝因素和不同批次間藥材含量的高低變化，以及成品片重差異范圍等影響含量變化因素，為確保成品質(zhì)量，暫定本品每粒含黨參、陳皮和當(dāng)歸以阿魏酸（C10H10O4）計(jì),不得少于0.0450 mg。