脾寒草生物活性成分的提取和探究

伍勇 王志明 薛飛龍

摘 要：文章以采自四川涼山州的脾寒草為原料，通過不同工藝對脾寒草生物活性成分進行提取，探究脾寒草生物活性成分，并對其活性成分進行定性與定量研究，以為脾寒草資源的綜合開發利用提供理論依據。研究的主要內容與結果如下：①采用外標法，通過HPLC對脾寒草粗提物進行初步定性，結果表明，組分Ⅰ為桃葉珊瑚苷。②以桃葉珊瑚苷提取率為最終的考量指標，探討提取工藝對生物活性成分提取的影響。實驗結論是，最佳方法是酶輔助提取法，工藝條件為乙醇濃度80%、料液比1∶10（g∶ml）、提取溫度40℃、酶法提取時間為60min，總桃葉珊瑚苷提取量可達3.654mg/g。

關鍵詞：脾寒草；桃葉珊瑚苷；抗氧化活性；高效液相色

脾寒草學名直立婆婆納（Veronica arvensis L.），玄參科婆婆納屬植物，全體具細軟毛，莖直立，或下部略偃伏，高10～30cm，一年或二年生草本，原產中國西藏、云南西北部，在四川省涼山州境內也有分布，在民間醫療中，其被選作傷風流感引起的頭疼發熱治療藥物，亦用作日常飲品，保健用。而有關脾寒草的研究報道極少，據相關文獻研究，直立婆婆納同屬的許多種類，全草藥用，具有多種藥效。《中國藥植圖鑒》中寫到脾寒草主治瘧疾，而在涼山州民間，彝族醫藥里也用作為補品，用以養肝護肝。近幾年，國內外學者對婆婆納屬植物的藥理學研究報道不斷增多，發現其在抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗微生物等方面均有良好的活性。根據趙一等人的研究，用直立婆婆納的干全草制成流浸膏，初步確證有抗瘧作用。近幾年國內外學者對婆婆納屬植物的藥理學研究報道不斷增多，對婆婆納屬植物的生物活性成分的探究越來越廣泛和深入，但就脾寒草的生物活性成分研究仍然存在大量的空白。因此，開展脾寒草的理論研究，可以填補其研究空白，為其開發利用提供依據。

國內對婆婆納屬植物的化學成分研究主要是對輪葉婆婆納、長果婆婆納、毛果婆婆納的研究，針對婆婆納屬藥用植物的化學成分研究報道主要集中在苯乙醇苷類化合物，環烯醚萜苷類化合物，黃酮類化合物以及有機酸。有關植物活性成分提取的工藝主要回流提取、超聲波提取、酶輔助提取。回流提取以乙醇和甲醇作為提取環烯醚萜苷類物質最常用的兩種有機溶劑，最后將提取液進行過濾、濃縮；超聲波輔助提取法是對環烯醚萜苷類物質進行提取的另一種新型的提取法，其利用超聲波對環烯醚萜苷類物質進行提取，原理是超聲波具有空化、粉碎和攪拌作用，破壞植物藥材的細胞，加速溶劑的運動，使溶劑更容易滲透到細胞中，從而讓環烯醚萜苷類物質溶于提取溶液中，最后分離出活性成分；酶輔助提取法是指在提取環烯醚萜苷類物質的過程中，向其中加入活性酶，引起細胞中相關底物發生轉糖反應和酶解反應，提高環烯醚萜苷類物質得率的新興技術。

通過查閱脾寒草同屬種植物的研究資料，結合崔紅梅、張仁波、田亮、張彥文、高坤等人的研究報道表明其活性成分主要有：黃酮類物質（丹參酮Ⅰ（Ⅶ））、隱丹參酮（Ⅳ）、二氫丹參酮Ⅰ（Ⅵ）、1，2-去氫隱丹參酮（Ⅰ）、丹參酮ⅡA（Ⅷ），有機酸類物質（3-甲氧基-4-羥基苯甲酸、3，4-二甲氧基苯甲酸3，4-二甲氧基桂皮酸、3-O-乙酰齊墩果酸、異阿魏酸和3-羥基-4-甲氧基苯甲酸），苯乙醇苷類（胡蘿卜苷Ⅱ、D-甘露醇、β-谷甾醇），環烯醚萜苷類（6-Overatroylcatalposide、6-Oisovanilloylcatalpole、catalposide、verproside、amphicoside，桃葉珊瑚苷）。因此推測脾寒草中含有的活性成分可能有黃酮類、苯乙醇苷類、有機酸、環烯醚萜苷類。

根據Chang，H-Moo等人對肝損傷治療藥物的研究，發現婆婆納屬的多種植物，普遍存在桃葉珊瑚苷，據此推測脾寒草生物活性成分中可能含有桃葉珊瑚苷。桃葉珊瑚苷（aucubin，AU），化學名為β-D-吡喃葡萄糖苷，是一種植物的次生代謝產物，是一種環烯醚萜苷類化合物。它能夠有效地促進干細胞再生，并且能夠明顯地抑制乙型肝炎病毒DNA的復制，桃葉珊瑚苷的苷元及其有效多聚體是一種抗菌素。桃葉珊瑚苷具有保肝、護肝、降壓、利小便、鎮痛、清濕熱、抗腫瘤等多種活性成分。桃葉珊瑚苷是某些成藥的質量指標，又是傳統中藥杜仲、車前草、地黃的主要活性成分。

關于桃葉珊瑚苷的生物活性報道較多，由于桃葉珊瑚苷極性大，分子小極性大，所以可以用乙醇、甲醇、水等極性溶劑進行提取，但是提取的溫度、時間、方法等對提取效率依舊有明顯影響。藥物的藥用活性成分除了藥物本身的性質決定，還與其不同的提取工藝有關，介于對其脾寒草的生物活性成分的提取和分析的研究空白，參照其他中藥材的提取工藝流程，選擇了三種提取工藝對其生物活性成分進行提取和分析。對比不同工藝條件下桃葉珊瑚苷等生物活性成分含量以及成分分析，并對比不同提取產物的抗氧化活性，探究脾寒草的生物活性成分，彌補脾寒草的研究空白，選擇合理的提取工藝，為脾寒草的研究提供理論依據。

一、材料與方法

1.試驗材料

實驗所用藥材為彝族藥材脾寒草，于2017年采集于四川省涼山州，整株用于藥用，部分從當地民間診所直接購買，在實驗中心陰干備用。

2.主要試劑

主要有桃葉珊瑚苷標準品（色譜純，叮當時代醫藥科技有限公司），甲醇（分析純），乙腈（色譜純），DPPH（分析純），纖維素酶（化夏試劑有限公司），果膠酶（上海瑞勇生物科技有限公司）。

3.主要儀器設備

主要有超聲波清洗機（潔康超聲波清洗機PS-D40A），島津高效液相色譜儀（島津LC3000，單元泵LC-20AT，檢測器SPD-20A，柱溫箱CTO-10AS，自動進樣器SIL-20A），干燥箱（GZX-DH202-1-BS-II，上海賀德實驗設備有限公司），電子天平（FA2004分析電子天平，上海良平儀器儀表有限公司）。

4.實驗方法

（1）提取方法。超聲波提取法：精密稱定取脾寒草藥材粉末1g（過三號篩），加入10%乙醇10mL，稱定總的質量，利用超聲處理60min（功率250W，溫度40℃），冷卻至室溫；用10%乙醇補足減失的質量，混合均勻后，利用布氏漏斗過濾，得100mg/ml的脾寒草供試品溶液。

（2）抗氧化性檢測方法。DPPH自由基清除力測定原理是，DPPH在有機溶劑中呈紫色，且在517nm處有較大吸收，當加入抗氧化劑一部分自由基被清除掉，使該波長被吸收，通過吸光值的大小來判斷物質的抗氧化活性高低。

參照唐建波等分析刺梨多糖抗氧化性的測定方法，采用DPPH自由基清除作用測定脾寒草供試品的抗氧化性。量取100mg/ml的供試品溶液2ml，加水定容至10ml，配成質量濃度為20mg/ml樣品，再以該質量濃度稀釋成所需的濃度。于棕色容量瓶中，以無水乙醇作為溶劑配制0.16mmol/LDPPH溶液。

取3mlDPPH溶液，等體積加入待測樣品稀釋液，25℃水浴15min后，517nm波長下測得試樣吸光度（Ai），以蒸餾水代替樣品測得空白吸光度（Ao），以無水乙醇代替DPPH溶液測得樣品本底吸光度（Aj），以抗壞血酸作陽性對照，按下式計算清除率： K（%）=[Ao-（Ai-Aj）]/Ao×100。

（3）高效液相色譜檢測。脾寒草提取溶液首先進行紫外分光光度法，進行全波長掃描確定最大吸峰值，其次進行高效液相檢測，采用外標法，對脾寒草供試品進行高效液相色譜分析，稱取桃葉珊瑚苷對照品5mg，置于25mL棕色量瓶中，加入無水乙醇24ml，冷卻后，用無水乙醇定容，得到0.2mg/mL桃葉珊瑚苷對照品儲備溶液，藥品用過0.45?m微孔濾膜，4℃保存待用。

液相色譜條件，參照標準∶流動相為乙腈∶水（5∶95），檢測波長為190nm；結合崔紅梅等分析毛果婆婆納中桃葉珊瑚苷的方法，采用流動相為乙腈∶水（5∶95），流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，350nm，進樣量體積設置為20μL。

二、結果與分析

1.抗氧化活性分析

本研究測定了100mg/ml的脾寒草供試品的DPPH自由基清除能力，脾寒草供試品對DPPH自由基清除作用的半清除濃度IC50為3.2531mg/ml，表明脾寒草供試品有良好的抗氧化活性。隨著脾寒草提取液的濃度上升，抗氧化活性急劇上升，當質量濃度達到10mg/ml時清除率就達到了79.65%。

2.脾寒草供試品高效液相色譜分析

（1）檢測波長選擇。脾寒草供試品溶液全波長（190～700nm），掃描結果是，在190nm處對照品桃葉珊瑚苷有最大吸收，經光譜等高線分析優化檢測條件，選擇210nm，350nm為檢測波長，雜質干擾更少。

（2）高效液相色譜分析。為進一步驗證，采用高效液相色譜對桃葉珊瑚苷標準品進行定性分析，其結果顯示，組分桃葉珊瑚苷出峰時間為4.501min，脾寒草供試品經高效液相色譜洗脫的結果，再在相同的高效液相色譜條件下進行定性分析，通過組分保留時間的對比，可以看出相同高效液相色譜條件下，組分Ⅰ保留時間為4.461，這與主峰的出峰時間基本一致，因此，初步判定組分Ⅰ為桃葉珊瑚苷。

3.不同工藝樣品高效液相色譜檢測結果

將制備的九種樣品溶液按上述色譜條件進樣分析，進樣量20μL，記錄色譜圖，外標法計算桃葉珊瑚苷的質量分數，結果如下：

脾寒草桃葉珊瑚苷的含量與提取率如下表：

參考文獻：

[1]田 亮，周金云.婆婆納屬植物的研究進展[J].中藥材，2004（1）.

[2]張仁波，竇全麗.國內婆婆納屬藥用植物研究進展[J].科技資訊，2009（31）.