超聲-微波協同萃取法提取桑葉γ-氨基丁酸的工藝研究

鐘楊生，陳恒文，陳芳艷，林健榮

（華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642）

桑葉為?？浦参锷洌∕orus albaL.）的葉子。據《神農本草》記載，桑葉味苦、甘，能夠疏散風熱、清肝明目、清肺潤燥，具有降血糖、降血脂、抗衰老等作用。通過近代藥理學的研究和分析發現桑葉中的功效成分有黃酮、多糖、生物堿等活性物質［1-3］。本課題組在開展桑葉活性物質的研究時發現，抗青10號、云陽、大紅皮等品種的桑葉富含γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA)，尤其在桑嫩芽中含量更高［4-6］。GABA是哺乳動物神經中樞的一種抑制性遞質，具有調節血壓、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活力、營養神經細胞、增加生長激素分泌、健肝利腎、促進乙醇代謝（醒酒）等多種功效［7-10］。2009年衛生部已正式批準GABA為新資源食品，隨著人們對GABA研究的不斷深入，GABA作為新型功能因子逐漸被運用于食品、飼料、醫藥及化妝品等領域［11-12］。桑樹在我國種植范圍廣、產量高、生產成本低、資源豐富，對桑葉GABA進行研究并加以開發利用，具有重要的科學價值和廣闊的市場前景。

依據GABA水溶性的特點，通常以水為溶劑提取，但傳統的提取方法提取時間長、提取效率低［15］。微波輔助萃取法相對于傳統方法可縮短提取時間、提高提取效率、降低能耗［16-18］。超聲-微波協同萃取技術則是將超聲波和微波結合在一起的新技術。超聲波利用在溶劑和樣品間產生的聲波空化作用，可增大物質分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，提高藥物溶出速度和溶出量。微波的電場能夠引起分子運動，極性分子在微波電磁場的作用下，產生瞬間極化，從而產生鍵的振動、撕裂和粒子之間的相互摩擦、碰撞，使分子極性部分更好地接觸和反應，同時迅速生成大量熱能。物質吸收微波能，細胞內部溫度迅速上升，壓力超過細胞壁膨脹承受能力，使細胞破裂，細胞內有效成分自由流出，從而有利于細胞中物質的提取［19-22］。鐘楊生等［15-16］報道了用傳統提取法和微波輔助萃取法萃取桑葉GABA的工藝，但目前尚未見用超聲-微波協同萃取法提取桑葉GABA 的報道。本文采用超聲-微波協同萃取法提取桑葉GABA，可為下一步開展桑葉GABA活性功能研究打下基礎，為桑葉的進一步開發利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗青10號桑葉由華南農業大學動物科學學院提供。桑葉經水洗后60℃干燥粉碎過630 μm篩，用甲醇去色素后干燥，置于4℃條件下冷藏備用；γ-氨基丁酸（GABA）標準品購自美國Sigma公司；次氯酸鈉、重蒸酚、氫氧化鉀、無水乙醇、三氯化鑭、碳酸鈉、碳酸氫鈉等均為分析純試劑。

CW-2000型超聲-微波協同萃取儀為上海新拓微波溶樣測試技術有限公司產品，微波功率10～800 W，微波頻率2 450 MHz，超聲波功率50 W，超聲波頻率40 KHz；UV-1700紫外分光光度計為日本島津儀器（蘇州）有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 GABA含量測定 參照文獻［4，23］的方法進行不同濃度GABA標準液配制，在645 nm波長下測定吸光值，根據測得的吸光值以及相對應的GABA含量制作標準曲線。根據標準曲線制作方法得到回歸方程y=0.6827x+0.0249（R2=0.9923），表明 GABA濃度與吸光度具有良好的線性關系。取適量樣品提取液按標準曲線制作方法測定吸光度，通過標準曲線計算樣品每克干桑葉中GABA的含量。

1.2.2 料液比對GABA提取量的影響 準確稱取2 g桑葉6份，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL)加入蒸餾水，在微波功率100 W、超聲波功率50 W的條件下提取2 min，提取次數為1次，測定GABA含量。

1.2.3 微波功率對GABA提取量的影響 準確稱取2 g桑葉8份，固定料液比1∶20，提取2 min，提取1次，超聲波功率50 W(超聲波功率固定，不可調)，調節微波功率為50、100、150、200、250、300、350、400 W，測定GABA含量。

1.2.4 提取時間對GABA提取量的影響 準確稱取2 g桑葉6份，固定微波功率100 W、超聲波功率50 W、料液比1∶20加水，提取1次，分別提取1、2、3、4、5、6 min，測定GABA含量。

1.2.5 提取次數對GABA提取量的影響 準確稱取2 g桑葉3份，固定微波功率100 W，超聲波功率50 W、料液比1∶20加水、提取2 min，分別提取1、2、3次，測定GABA含量。

1.2.6 Box-Behnken響應面試驗優化 在單因素實驗的基礎上，每個因素選取3個對GABA提取量影響較大的水平，建立3因素3水平的Box-Behnken中心試驗，以GABA提取量為響應值，各因素3水平采用-1、0、1進行編碼（表1）。

表1 Box-Behnke試驗水平和編碼

采用Design-Expert V8.0.6 軟件對試驗數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素對GABA提取效果的影響

2.1.1 料液比對桑葉GABA提取量的影響 從圖1可以看出，GABA提取量隨著料液比的增加而增加，當料液比增大到1∶40時，繼續增大料液比提取率變化不大。從提取效率以及產品后加工的濃縮處理工序考慮，選擇最適宜的料液比為1∶40。

圖1 料液比對桑葉GABA提取量的影響

2.1.2 微波功率對桑葉GABA提取量的影響 在料液比為1∶40條件下，研究微波功率對提取效率的影響，結果見圖2。GABA的提取量隨著微波功率的增大而增加，在150 W時提取量達最大值，之后GABA提取量隨著微波功率增加反而略有降低。可能是由于在低功率時分子運動不劇烈，破細胞效果不明顯，故GABA浸出率不高；隨著微波功率的不斷增加，分子運動加劇，有利于GABA的溶出；而當微波功率進一步加強時，其強熱效應可對GABA產生破壞而減少，造成提取率下降；另外微波功率過高容易產生爆沸現象。因此，選擇150 W為最佳提取功率。

圖2 微波功率對桑葉GABA提取量的影響

2.1.3 提取時間對桑葉GABA提取量的影響 由圖3可知，提取時間在3 min時GABA提取量最大，之后隨著提取時間延長，其提取效率增加并不明顯?？赡芤驗槌?、微波處理能使細胞在短時間內迅速破裂，GABA快速溶出，使溶質迅速達到固液平衡，因此延長時間效果不理想。因此，選擇最佳微波處理時間為3 min。

圖3 提取時間對桑葉GABA提取量的影響

2.1.4 提取次數對桑葉GABA提取量的影響在上述最佳提取條件下，考察提取次數對桑葉GABA提取量的影響。連續提取3次，第1次提取量是總提取量的91%、第2次為5%、第3次為4%。盡管總提取量隨著提取次數的增加而增加，但是第2次和第3次增加的幅度都很小，因此，選擇提取1次。如果有連續提取設備，可采用逆流提取提高效率。

2.2 超聲-微波協同萃取法的Box-Behnken試驗

在單因素試驗的基礎上，對影響桑葉GABA提取量最為密切的料液比、微波功率和提取時間這3個因子進行Box-Behnken組合設計，結果見表2。根據表2結果計算各項回歸系數，以這些回歸系數建立桑葉GABA提取量與料液比（X1）、微波功率（X2）和提取時間（X3）3個因子的回歸方程：

方差分析顯著性檢驗結果（表3）表明，該模型與試驗擬合較好，回歸方程R2=0.9916，自變量與響應值線性關系顯著，可以用于桑葉GABA超聲-微波輔助提取試驗的理論預測。在P=0.05顯著水平剔除不顯著項，得到優化方程為：

表2 Box-Behnken試驗設計及實驗結果

從回歸系數的顯著性檢驗可以看出，微波功率（X2）與提取時間（X3）的互作效應對桑葉GABA提取量影響明顯，從響應面圖（圖4）可知，在所設計的實驗條件范圍內，微波功率和提取時間都可增加桑葉GABA提取率，二者交互作用表現為桑葉GABA提取量增大。

采用貢獻率法對各因素的重要性分析可知，料液比、微波功率和提取時間對提取率的貢獻率分別為2.4158、2.3669和2.4365，對桑葉GABA提取量作用大小依次為提取時間＞料液比＞微波功率。微波處理時間長短對提取量的影響最大，可能是因為微波穿透能力極強，直接作用于桑葉細胞內部，使有效成分很快溶出，同時可使溶劑溫度升高較快，有利于有效成分的提取。

表3 回歸模型及方差分析

圖4 微波功率和提取時間對GABA提取量的交互作用

通過SAS響應面分析，并結合數學模型，超聲-微波協同提取桑葉GABA的最優參數為：料液比1∶34，微波功率為144 W，提取時間為165 s。在此工藝條件下桑葉GABA提取的理論值為5.77 mg/g。采用上述最優條件進行GABA提取，結果實際得到桑葉GABA的提取量為5.83 mg/g，與理論值相比相對誤差很小。

3 結語

本試驗選用超聲-微波協同萃取法提取桑葉GABA，以蒸餾水為溶劑，研究超聲波-微波的功率、料液比及提取時間對提取率的影響。在單因素試驗結果的基礎上，運用Box-Behnken旋轉組合設計試驗，確定了最適的提取工藝，并按最佳工藝進行了驗證試驗，優選出超聲-微波協同提取桑葉GABA的最優參數為：料液比1∶34，超聲波功率為50 W，微波功率為144 W，處理時間為165 s，提取1次。在此工藝條件下提取量為5.83 g/mg。各影響因素貢獻率表現為提取時間＞料液比＞微波功率。

采用超聲-微波協同萃取法提取桑葉γ-氨基丁酸（GABA）提取率高、提取時間短，抗青10號的桑葉GABA提取量為5.83 mg/g，提取時間為165 s；傳統水提取法提取桑葉GABA,提取時間為 2.13 h，在同一品種同一測定方法條件下桑葉GABA提取量為 4.64 mg/g［15］；而微波輔助萃取法處理時間為 11.69 min，提取量為5.83 mg/g［16］?？梢姡捎贸?微波萃取法可顯著提高生產效率。