復(fù)方氯霉素乳膏的處方篩選及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

喻 吉 ，林 彩 ，孫紅武 ，2△，楊欽君

（1.中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400038； 2.國(guó)家免疫制品工程技術(shù)研究中心·中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系微生物與生化藥學(xué)教研室，重慶 400038）

氯霉素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌等有效，尤其對(duì)引起痤瘡的痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌等具有顯著抗菌作用[1]。甲硝唑?qū)?dǎo)致痤瘡的厭氧菌及增生性的毛囊蟲(chóng)有明顯殺滅作用[2]。本研究中以甲硝唑與氯霉素為主藥，配以不同的乳膏基質(zhì)，共獲得7個(gè)處方，按乳膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3－4]考察乳膏質(zhì)量，獲得最優(yōu)處方，制備出復(fù)方氯霉素乳膏。由于復(fù)方氯霉素乳膏中，甲硝唑與氯霉素對(duì)臨床療效具有至關(guān)重要的作用，因此對(duì)其兩種主藥的含量測(cè)定對(duì)于其質(zhì)量控制具有重要意義。目前，甲硝唑與氯霉素的含量測(cè)定方法有高效液相色譜（HPLC）法、雙波長(zhǎng)分光光度法、多波長(zhǎng)系數(shù)法、比色法等，HPLC法具有重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[5－8]。本研究中擬建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方氯霉素乳膏中甲硝唑與氯霉素含量的HPLC法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BME－1002型高剪切乳化機(jī)（上海威宇機(jī)電有限公司）；KQ－600V型離心機(jī)（上海威爾機(jī)電制造有限公司）；TE4101－L型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ－400KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；DU650型紫外分光光度計(jì)（Beckman Coulter公司）；Waters2487型高效液相色譜儀紫外檢測(cè)器、Waters 510 Pump型高效液相色譜儀二元泵（美國(guó)Waters公司）；Diamondsil C18色譜柱（150 mm ×4.6 mm，5μm，迪馬科技有限公司）；Mini－Q Plus 1.5 L／min型純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

甲硝唑（武漢武藥制藥有限公司，批號(hào)為150380）；氯霉素（南京白敬宇制藥有限公司，批號(hào)為CH150404）；螺內(nèi)酯（浙江郎華制藥有限公司，批號(hào)為1501004）；甘油（批號(hào)為 20150314），吐溫 － 80（批號(hào)為 20140501），均由湖南爾康制藥股份有限公司生產(chǎn)；HR－S乳化劑（丹東安康精細(xì)化工有限公司，批號(hào)為20150407213）；白凡士林（南昌白云藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20150603）；丙二醇（南京威爾化工有限公司，批號(hào)為20150503）；單硬脂酸甘油酯（沈陽(yáng)科瑞化工有限公司，批號(hào)為20140925）；硬脂酸（湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為20141205）；16－18醇（江蘇東泰精細(xì)化工有限公司，批號(hào)為2014121204）；Span－60（河南正通化工有限公司，批號(hào)為20150210）；十二烷基硫酸鈉（成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司，批號(hào)為20140501）；液體石蠟（吉林市吉化江城油脂化工有限責(zé)任公司，批號(hào)為150202）；甲硝唑?qū)φ掌罚ㄅ?hào)為100191－201507），氯霉素對(duì)照品（批號(hào)為130555－201203），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純，美國(guó)Burdick＆Jackson公司）；復(fù)方氯霉素乳膏（自制，批號(hào)分別為 160105－1，160105－2，160126 －1，160126 －2，160126 －3）。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方設(shè)計(jì)與篩選

2.1.1 處方設(shè)計(jì)

按復(fù)方氯霉素乳膏基質(zhì)成分配制比例及配制溫度，篩選處方，設(shè)計(jì)出7個(gè)處方。詳見(jiàn)表1。其中配置溫度除處方3為60℃外，其余處方均為80℃。

表1 復(fù)方氯霉素乳膏處方（g）

2.1.2 乳膏制備

處方1，2，6：油相，按處方量稱(chēng)取單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、Span－60，混合加熱，熔化，加入螺內(nèi)酯使其溶解，溶液保持80℃。水相，按處方量稱(chēng)取水，加熱至80℃后，加入甲硝唑與氯霉素，攪拌，使其完全溶解，然后加入甘油或丙二醇、吐溫－80混勻。將80℃油相加至80℃的水相。

處方3：油相，按處方量稱(chēng)取單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、Span－60，混合加熱，熔化，加入螺內(nèi)酯使其溶解，溶液保持60℃。水相，按處方量稱(chēng)取水，加熱至60℃后，加入甲硝唑與氯霉素，攪拌，使其完全溶解，然后加入甘油或丙二醇、吐溫－80混勻。將60℃油相加至60℃的水相。

處方4，7：油相，按處方量稱(chēng)取16－18醇、單硬脂酸甘油酯、輕質(zhì)液狀石蠟，混合加熱，熔化，然后加入螺內(nèi)酯使其溶解，溶液保持80℃。水相，按處方量稱(chēng)取水，加熱至80℃后，加入甲硝唑與氯霉素，攪拌使其完全溶解，然后加入十二烷基硫酸鈉、甘油后混勻。將80℃水相加至80℃的油相。

處方5：油相，按處方量稱(chēng)取單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、16－18醇、輕質(zhì)液狀石蠟，混合加熱，熔化，然后加入螺內(nèi)酯使其溶解，溶液保持80℃。水相，按處方量稱(chēng)取水加熱至80℃后，加入甲硝唑與氯霉素，攪拌，使其完全溶解，然后加入甘油、HR－S乳化劑后混勻。將80℃油相加至80℃的水相。

各處方油相水相相加時(shí)均隨加隨攪拌，攪勻后上機(jī)乳化25 min，冷卻，分裝。

2.1.3 質(zhì)量評(píng)價(jià)與處方篩選結(jié)果

對(duì)復(fù)方氯霉素乳膏外觀、黏稠度、粒度、4 000 r／min離心10 min后的穩(wěn)定性、晶體析出時(shí)間進(jìn)行考察，判定制備的復(fù)方氯霉素乳膏的質(zhì)量。對(duì)制備的7個(gè)復(fù)方氯霉素乳膏處方的試驗(yàn)結(jié)果表明，處方5制備的乳膏最美觀，手感最細(xì)膩，粒度最小，黏稠度適中，且最穩(wěn)定。故處方5為最佳處方。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)確定

稱(chēng)取甲硝唑?qū)φ掌放c氯霉素對(duì)照品10 mg，精密稱(chēng)定，分別用甲醇溶解稀釋?zhuān)?00～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果甲硝唑、氯霉素最大吸收波長(zhǎng)分別為273 mm和295 nm，綜合考慮，選擇280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Diamondsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇 －水（35 ∶65）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；靈敏度：0.1AUFS；進(jìn)樣量：10μL；流速：1.0mL ／min；柱溫：30℃。

2.2.3 溶液制備

分別稱(chēng)取甲硝唑與氯霉素對(duì)照品各10.1 mg，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度均為0.404 g／L的混合貯備液，配制成對(duì)照品溶液。稱(chēng)取含或不含甲硝唑與氯霉素的復(fù)方乳膏0.13 g，精密稱(chēng)定，加入甲醇溶解至25 mL容量瓶中，定容并混勻，超聲處理10 min，4 000 r／min離心5 min，取上清液，配制供試品溶液、空白基質(zhì)溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取甲硝唑與氯霉素對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白基質(zhì)溶液，依法進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，對(duì)照品溶液中甲硝唑的保留時(shí)間為2.244 min，氯霉素為9.510 min；供試品溶液的兩主峰和甲硝唑、氯霉素對(duì)照品的色譜峰保留時(shí)間基本一致，且兩主藥的分離度好；同時(shí)空白基質(zhì)溶液在上述保留時(shí)間處無(wú)明顯色譜峰，表明其對(duì)檢測(cè)無(wú)明顯干擾。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別吸取甲硝唑與氯霉素質(zhì)量濃度均為0.404 g／L的混合貯備液，加甲醇制得兩藥質(zhì)量濃度 均 為 40.40，44.44，48.48，52.52，56.56，60.60，64.64μg／mL的溶液。吸取上述溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，每份溶液測(cè)定3次，計(jì)算峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，甲硝唑?yàn)?Y＝224.49 X－219.4，r＝0.999 9（n＝7）；氯 霉 素 為 Y＝375.5 X－853.11，r＝0.999 8（n＝7）。結(jié)果表明，兩藥質(zhì)量濃度在 40.40～64.64μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系均良好。

精密度試驗(yàn)：分別量取質(zhì)量濃度為40.40，52.52，64.64μg／mL的甲硝唑與氯霉素溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣3次，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度。取等量相同溶液，分別于0，24，48 h時(shí)注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

檢測(cè)限與定量限確定：將已知質(zhì)量濃度樣品測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算能被檢測(cè)出的最低質(zhì)量濃度與能被定量的質(zhì)量濃度。以信噪比為3∶1時(shí)相應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，以信噪比為10∶1時(shí)相應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果甲硝唑的檢測(cè)限與定量限分別為 1.31μg／mL 和 3.79μg／mL，氯霉素的檢測(cè)限與定量限分別為2.28μg／mL和7.33μg／mL。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取甲硝唑與氯霉素質(zhì)量濃度均為0.404 g／L的混合貯備液，加甲醇制成兩藥質(zhì)量濃度均分別為 40.40，52.52，64.64μg／mL的混合溶液各2份，1 份常溫放置，1 份冰箱（4 ℃）放置，分別于 0，24，48 h時(shí)各取10μL注入高效液相色譜儀，記錄甲硝唑與氯霉素的峰面積，并計(jì)算 RSD。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

加樣回收試驗(yàn)：分別配制甲硝唑和氯霉素高、中、低質(zhì)量濃度（67.80μg／mL 和 65.92μg／mL，55.12μg／mL和 53.56μg／mL，42.40μg／mL和 41.20μg／mL）對(duì)照品溶液。稱(chēng)取復(fù)方氯霉素乳膏樣品132.5 mg，精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液，取0.5 mL，加至3種質(zhì)量濃度的甲硝唑及氯霉素混合對(duì)照品液0.5 mL中，混勻，4 000 r／min離心10 min，取10μL注入高效液相色譜儀，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

2.2.5 樣品含量測(cè)定

用甲醇分別配制甲硝唑和氯霉素質(zhì)量濃度均為52.00μg／mL的對(duì)照品溶液；取5批次的乳膏樣品0.1 g，用甲醇溶解并定容至25 mL，超聲10 min，4 000 r／min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。取甲硝唑與氯霉素對(duì)照品混合液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄甲硝唑與氯霉素相應(yīng)的峰面積。計(jì)算供試品溶液中甲硝唑與氯霉素的質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算復(fù)方氯霉素乳膏中甲硝唑與氯霉素的含量。結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 甲硝唑加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

表5 氯霉素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝5）

3 討論

本研究中以對(duì)痤瘡致病菌有效的氯霉素和甲硝唑?yàn)橹魉嶽9－11]，設(shè)計(jì)出7種不同乳膏的處方，根據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，對(duì)制劑外觀、粒度、4 000 r／min離心 10 min后的穩(wěn)定性、晶體析出時(shí)間等重要質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行考察[12]，以獲得最佳處方。

本研究中曾選擇甲醇－水（50∶50）為流動(dòng)相，結(jié)果甲硝唑與氯霉素峰的保留時(shí)間分別為1.85min和3.60min，兩者無(wú)法完全分離；流動(dòng)相為甲醇－水（45∶55）和（40 ∶60）[13－14]時(shí)，甲硝唑與氯霉素峰分離效果較好，但甲醇保留時(shí)間為1.40 min，與甲硝唑峰分離度不好；當(dāng)流動(dòng)相為甲醇 －水（35 ∶65）[15]時(shí)，甲醇、甲硝唑、氯霉素的分離效果均較好。

在處理復(fù)方氯霉素乳膏樣品時(shí)，可對(duì)其進(jìn)行超聲處理[15]，增加溶解；樣品進(jìn)樣前，溶液需離心，取上清液，消除基質(zhì)的干擾；由精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，甲硝唑與氯霉素相應(yīng)項(xiàng)目下的 RSD值均小于2%，表明甲硝唑與氯霉素溶液較穩(wěn)定；測(cè)定樣品時(shí)，因流動(dòng)相中甲醇易揮發(fā)，流動(dòng)相必須使用當(dāng)天配制。