木姜葉柯中根皮苷與三葉苷含量測定研究*

張亞洲 ，王 濤 ，朱晶晶 ，2，劉 學(xué) ，2，周福才 ，王 強

（1.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003； 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，貴州 貴陽 550001； 3.廣西苷亮健生物技術(shù)有限公司，廣西 南寧 530001）

木姜葉柯為殼斗科柯屬植物 Lithocarpuslitseifolius（Hance）Chun.，屬常綠喬木，別名甜茶（通稱）、甜葉子樹（云南）、胖稠（廣東）、甜味菜、大葉稠子、甘茶（貴州）、多穗石柯等，以野生狀態(tài)分布于我國長江以南各省區(qū)海拔500～2 500 m的低山密林中，印度、泰國也有分布[1]。現(xiàn)代研究表明，木姜葉柯中的黃酮類成分是其主要化學(xué)成分，主要有根皮苷與三葉苷，屬二氫查爾酮類成分[2－4]。木姜葉柯（甜茶）使用廣泛，于2017年6月通過了國家衛(wèi)生計生委的新資源食品評審，其具有降血糖、降血壓、調(diào)血脂及抗過敏、抗炎等作用，尤其所含根皮苷防治糖尿病及其并發(fā)癥有獨特效果[5－8]。本研究中對收集的主要產(chǎn)區(qū)的木姜葉柯各種市售甜茶成品及原植物中根皮苷與三葉苷含量進行測定，以了解市場上產(chǎn)品及原植物中根皮苷及三葉苷的含量，為木姜葉柯產(chǎn)品開發(fā)提供借鑒。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Series型高效液相色譜儀（包括1260 DAD型檢測器，美國安捷倫科技有限公司）；BSA124S型分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司）；KQ－300DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

乙腈，甲醇（均為HPLC級，成都科龍試劑有限公司）；磷酸（分析純，北京化工廠）；水為娃哈哈純凈水；根皮苷對照品（含量＞99%，批號為20161012），三葉苷對照品（含量 ＞98%，批號為20160825），均購于成都德思特生物技術(shù)公司。木姜葉柯樣品為廣西

表1 收集的木姜葉柯原植物部位及茶的樣品信息

2 方法與結(jié)果[9－15]

2.1 藥材水分測定

參照2015年版《中國藥典（四部）》附錄0832（干燥失重測定法第二法）測定藥材水分。結(jié)果見表2。

表2 木姜葉柯藥材水分測定結(jié)果（n＝3）

2.2 檢測波長選擇

紫外－可見吸收光譜（UV）圖顯示根皮苷在285 nm波長處有最大吸收，而三葉苷在275 nm波長處有最大吸收（見圖1），綜合考慮，確定檢測波長為280 nm。

圖1 紫外光譜圖

2.3 樣品溶液制備與超聲時間選擇

稱取以上木姜葉柯樣品0.2 g，精密稱定并平行稱取3份，分別置100 mL容量瓶中，用甲醇超聲10，20，30 min使溶解，放冷后用甲醇稀釋至刻度，搖勻。用0.45μm微孔濾膜濾過，取濾液20μL進樣。結(jié)果樣品超聲20 min內(nèi)測定效果良好。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Phenomenex Gemini C18柱（250mm×4.6mm，5μm，美國菲羅門公司）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）－乙腈（B），梯度洗脫（見表 3）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：280 nm；進樣量20μL。在此條件下，根皮苷、三葉苷理論板數(shù)均大于4 000，分離度均大于1.5，色譜條件符合相關(guān)要求（見圖2）。苷亮健生物技術(shù)公司供應(yīng)或通過購買獲得，樣品均經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院董立莎教授鑒定為木姜葉柯，詳見表1。

表3 流動相梯度洗脫表（%）

圖2 高效液相色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：稱取根皮苷對照品25.0 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得A溶液；精密稱取三葉苷對照品23.0 mg置20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得B 溶液。分別精密吸取 A 溶液 4.00，3.00，2.00，1.00，0.50，0.20，0.10 mL，B 溶液 5.00，4.00，3.00，2.00，1.00，0.50，0.25 mL；置 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度溶液，進樣，記錄色譜圖。結(jié)果見表4。

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗：取2.5項下對照品溶液，搖勻，連續(xù)進樣6次，每次20μL，計算峰面積。結(jié)果根皮苷、三葉苷峰面積平均值分別為2 968.5和10 383.9，RSD分別為0.47%和0.37%（n＝6），表明儀器精密度較好。

穩(wěn)定性試驗：取2.3項下方法制備的同一樣品溶液，搖勻后，用微孔濾膜濾過，分別于 0，2，4，6 h 時進樣20μL。平行操作2次，測定峰面積，計算含量。結(jié)果根皮苷的相對百分含量分別為100.00%，100.18%，99.96%，100.24%，三葉苷的相對百分含量分別為100.00%，99.84%，99.93%，100.10%，表明樣品溶液在6 h內(nèi)測定穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：稱取同一份樣品（編號12）0.2 g（稱樣量分別為 0.200 3，0.201 2，0.200 2 g），精密稱定并平行稱取3份，分別用2.3項下樣品溶液制備方法配制，進樣20μL。結(jié)果根皮苷和三葉苷的平均峰面積分別為 14 856.4和51 200.5，RSD分別為0.68%和0.18%（n＝6），表明方法的重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量樣品（編號12）0.1 g，精密稱定并平行稱取9份，分別平行加入已知含有根皮苷（1.996 g／L）、三葉苷（6.034 g／L）的高、中、低濃度（125%，100%，75%）對照品溶液各3份，按樣品含量測定方法進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果見表5。

表5 加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

2.6 樣品含量測定

按2.3項下樣品處理方法處理樣品，依法測定含量。結(jié)果見表6。

表6 藥材樣品中根皮苷、三葉苷含量測定結(jié)果（n＝2）

3 討論

木姜葉柯在民間當(dāng)茶葉使用，其成分至今較為明確的有根皮素、根皮苷和三葉苷等，有降血糖、降血壓、調(diào)血脂及抗過敏、抗炎等作用。

曾探索在同一色譜條件下同時對根皮素、根皮苷和三葉苷進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分樣品中根皮素含量太低，導(dǎo)致無法同時與根皮苷和三葉苷進行測定。對部分市場上及自采的木姜葉柯樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)收集到的不同產(chǎn)地的15批樣品根皮苷與三葉苷的含量存在一定差異。老葉與枝條中成分以根皮苷為主，最高含量達9.04%，茶葉制品與鮮葉中成分以三葉苷為主，最高含量達24.35%。另就根皮苷與三葉苷總量而言，茶葉制品與鮮葉遠大于老葉和枝條，其中以標示產(chǎn)地為廣西南寧南陽鄉(xiāng)木姜葉柯種植地區(qū)的質(zhì)量較優(yōu)，根皮苷與三葉苷總的含量相對較高，達31.62%，分析原因在于為鮮葉加工而成，成分含量較高，且均以三葉苷為主。

因加工方法的不同，木姜葉柯有綠茶及紅茶2個品系，但從成分上來講，制茶加工過程并未改變鮮葉中三葉苷含量多數(shù)大于根皮苷的情況，故建議木姜葉柯茶制品應(yīng)在4月至9月用其鮮葉加工，所得品次較高。