復方二氯乙酸二異丙胺對食管癌的抗腫瘤活性及藥理學機制研究

宋竹梅，宋紅梅，桂金川，吳海波

（四川省達州市中心醫院，四川 達州 635000）

食管癌是排名全球前10的惡性腫瘤，我國食管癌每年新發及死亡人數約占全球的50%，是繼胃癌、直腸癌后極易發病的惡性腫瘤[1]。食管癌發病誘因多，如年齡、職業、飲食習慣及家族遺傳史等，其中吸煙和飲酒是重要的危險因素，且我國發病患者以鱗癌為主。雖然放射治療（簡稱放療）技術更加精確，不良反應也已相應降低，但大多數患者在治療時已處于中晚期，接受手術及放療、化學治療（簡稱化療）后效果不佳，預后很差，5年生存率不到20%[2]。有研究表明，機體糖酵解與食管癌的發生、發展密切相關，并與食管癌放療抵抗作用關系緊密[3]。另有研究表明，二氯乙酸二異丙胺（diisopropylamine dichloroacetate，DADA）在生理學角度可調節細胞代謝，逆轉糖酵解作用[4]。本研究中探討了DADA對食管癌的抗腫瘤活性及其藥理學機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

細胞培養皿：6，24，96孔細胞培養板及離心管（美國Corning公司）；低溫冰箱（日本三洋公司）；電子天平（上海精天電子儀器公司）；低溫離心機（德國西門子公司）；垂直電泳儀（美國Bio－Rad公司）；Western電轉儀（日本島津公司）等。

食管鱗癌細胞株Eca－109，TE－13（細胞株編號為TCHu 69，中國科學院）；二氯乙酸（dichloroacetic acid，DCA，行知生物科技有限公司）；二氯乙酸二異丙胺（武漢禾元生物科技有限公司）。細胞培養基及Annexin VFITC／PI細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；CCK－8 溶液（南京凱基科技有限公司）；Matrigel（美國Millipore公司）；Transwell小室（美國Corning公司）。

1.2 方法[5]

抗腫瘤活性分析：96孔板中每孔加入100μL轉染24 h后的對數期細胞，在5%CO2及37℃條件下單層鋪滿孔底，每孔加入10μL CCK－8溶液，其中將加入細胞培養液及CCK－8溶液未加細胞的孔作為空白對照，在450 nm波長檢測24 h時的吸光度。使用8μm膜小室及BDSioCoatTMMatrgelTMInvasion Chamber檢測DADA對食管癌細胞株的侵襲轉移作用。使用染色流式細胞技術及蛋白質印跡法（Western blot）檢測Caspase－3的活性形式來分析DADA對食管癌細胞株的凋亡作用。

藥理學機制分析：采用克隆形成試驗及多靶單擊模型探討DADA對食管癌細胞株放療的敏感性影響；制作大鼠皮下荷瘤模型，進一步驗證體內DADA聯合放療對放療敏感性的影響；運用Western blot、流式細胞儀檢測DADA聯合放療后食管癌細胞株內γ－H2AX的表達、細胞周期及細胞凋亡情況；運用活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒檢測DADA聯合放療后食管鱗癌細胞內ROS水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 DADA食管癌抗腫瘤活性分析

CCK－8細胞毒性試驗：結果顯示，24 h時，DADA作用于 Eca－109和 TE－13細胞株的半抑制濃度（IC50）分別為 18 mmol／L 和 22 mmol／L，DCA 作用于Eca－109和TE－13細胞株的 IC50分別為32 mmol／L和 33 mmol／L，表明 DADA 對 Eca－109和 TE－13細胞株的抗腫瘤活性強于DCA。

食管癌細胞株侵襲轉移作用：將 IC50時的DADA劑量作用于Eca－109和TE－13細胞株，檢測24 h后的細胞功能。與對照組相比，不管Matrigel還是Transwell小室試驗，DADA處理后的Eca－109和TE－13細胞株通過小室膜的細胞數大量減少（t1＝5.329、P1＝0.034，t2＝5.352、P2＝0.031），表明經過 DADA 處理過的食管癌細胞株遷移能力顯著減弱。細胞遷移圖像見圖1。

食管癌細胞株凋亡試驗：試驗結果顯示，經DADA處理過的食管鱗癌 Eca－109和 TE－13細胞株內Cleaved Caspase－3 蛋白含量顯著增加（χ21＝6.823、P1＝0.024，χ22＝6.897、P2＝0.021），表明經 DADA 處理過的食管鱗癌細胞株的凋亡細胞數明顯增加。詳見表1。

2.2 DADA藥理學機制分析

對食管癌細胞株放療敏感性的影響：研究結果顯示，對于食管鱗癌Eca－109和TE－13細胞株，DADA聯合放療較單純放療敏感度分別增加1.38倍和1.05倍。詳見表2。Western blot檢測γ－H2AX蛋白結果顯示，對于Eca－109和TE－13細胞株，DADA聯合放療與單用DADA、單用放療相比，γ－H2AX蛋白水平均顯著升高（χ21＝4.163、P1＝0.036，χ22＝4.731、P2＝0.034，χ23＝4.526、P3＝0.035，χ24＝4.953、P4＝0.031）。流式細胞儀檢測結果顯示，DADA聯合放療與單用DADA、單用放療相比，G2／M周期的細胞數量顯著升高（t1＝3.711、P1＝0.041，t2＝3.825、P2＝0.043）。表明 DADA 聯合放療可以增加DNA雙鏈的斷裂，使大量細胞阻滯在G2／M周期，從側面表明DADA可以通過多渠道增加放療敏感性。詳見表2。

圖1 食管癌細胞株遷移圖像

表1 DADA處理前后食管鱗癌Cleaved Caspase－3蛋白表達

表2 DADA對食管癌細胞株放療敏感性的影響

對食管癌細胞株放療敏感性體內驗證及ROS水平檢測結果：結果顯示，3組大鼠中，DADA聯合放療治療大鼠腫瘤體積及質量均顯著低于單用DADA及單用放療大鼠（P＜0.05），進一步說明DADA聯合放療可以增加放療敏感性，抑制腫瘤生長。DADA聯合放療大鼠的Eca－109和TE－13細胞株內的ROS水平顯著增加（P ＜0.05）。詳見表 3。

表3 3組大鼠治療后腫瘤質量及體積比較（±s）

表3 3組大鼠治療后腫瘤質量及體積比較（±s）

組別DADA聯合放療組DADA組放療組F值P腫瘤質量（g）10.31±2.18 15.69±1.96 16.71±2.04 1.803＜0.05腫瘤體積（cm3）2.62±0.42 4.19±0.94 5.27±1.27 13.073＜0.05 ROS（U ／mL）1443.45±59.39 1106.27±36.17 1242.98±42.62 5.247＜0.05

3 討論

食管癌預后不理想，5年生存率極低[6－7]，臨床治療方法主要有手術、化療、靶向治療及放療等，放療在治療癌癥方面起著重要作用，但不同癌種類、不同個體等對放療的敏感性不同[8－12]。有研究表明，癌細胞的能量代謝與放療的敏感性密切相關。二氯乙酸鹽可降低細胞糖酵解，作為抗腫瘤藥物已廣泛應用于臨床；DADA含有二氯乙酸鹽的活性成分，可影響機體內糖酵解調控細胞能量代謝[13－15]。

本研究結果顯示，DADA對Eca－109和TE－13細胞株的抗腫瘤活性高于DCA，經DADA處理后的Eca－109和TE－13細胞株，通過小室膜的細胞數目大量減少，表明經DADA處理過的食管癌細胞株遷移能力顯著下降。但細胞株內的Cleaved Caspase－3蛋白含量顯著增加，表明經過DADA處理過的食管癌細胞株細胞凋亡數量顯著上升，因為Cleaved Caspase－3是蛋白酶家族中具有促進細胞凋亡作用的Caspase－3的活性形式。

糖酵解與放療敏感性緊密相關，癌細胞糖酵解產生大量三磷酸腺苷（ATP）的同時可釋放很多大分子物質，如乳酸、丙酮酸等，而這些大分子可有效清除細胞中的氧化自由基（如ROS等），從而降低癌細胞對放療的敏感性[16－17]。本研究結果顯示，對于食管鱗癌Eca－109和TE－13細胞株，DADA聯合放療的放療敏感度增加1倍，而且Eca－109和TE－13細胞株中ROS水平顯著增加，說明DADA通過增加癌細胞株中氧化磷酸化水平而增加ROS水平，從而提高其放射治療敏感性，與上述研究推論一致。DADA聯合放療與單用DADA、單用放療相比，Eca－109和TE－13細胞株中γ－H2AX蛋白水平顯著升高，G2／M周期的細胞數量顯著升高，其中γ－H2AX蛋白是細胞DNA雙鏈損傷程度的標志物，γ－H2AX蛋白水平越高，DNA雙鏈損傷越嚴重，而放射治療的原理之一也是產生大量ROS，ROS進一步引起DNA雙鏈斷裂[18]。因此γ－H2AX蛋白水平的升高可從側面反映出DADA可增加食管鱗癌放射治療的敏感性。本研究結果顯示，DADA聯合放療治療大鼠，其腫瘤體積及質量均顯著低于單用DADA及單用放療（P＜0.05）。

綜上所述，DADA可抑制食管癌腫瘤細胞生長，促進凋亡，且抑制其遷移，與放療聯用可通過增加癌細胞中ROS水平而增加食管癌放療的敏感性，從而更好地發揮其抗腫瘤活性。