乳沒活絡散的鑒別和限量檢查研究*

陳思穎 ，田 勇 ，李莉娜 ，3，陸 苑 ，王永林 ，李勇軍 ，王愛民 △

（1.貴州醫科大學·貴州省藥物制劑重點實驗室 藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.思南田氏民族傳統骨傷醫院，貴州 銅仁 565100； 3.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫科大學·民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004）

乳沒活絡散是貴州省思南田氏民族傳統骨傷醫院根據具有200多年民間藥用歷史的家傳秘方研制開發的醫療機構制劑（黔藥制字Z20170134），具有活血化瘀、舒經活絡、消腫止痛的功效，可用于治療閉合性骨折、跌打扭傷及骨傷病變等疾病。該方針對骨折、跌打扭傷“氣滯血瘀證”遣方用藥，由三七、乳香、沒藥、制川烏、制草烏等10味中藥組方，經過30余年的臨床使用，療效顯著，深受患者歡迎。本研究中參考相關標準和文獻制訂了乳沒活絡散的顯微鑒別方法，對乳香、蘇木、續斷進行薄層色譜（TLC）鑒別，對制川烏、制草烏中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿限量進行檢查，以控制乳沒活絡散的質量，提高臨床用藥的有效性和安全性。現報道如下。

圖1 乳沒活絡散顯微鑒別圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

尼康50i顯微鏡和尼康DS－Fi2成像系統（放大倍率為10～1 500倍，日本尼康公司）；TLCACANNER 3型薄層色譜成像系統（瑞士卡瑪公司，參數：230V，50／60Hz，80 VA，UV 254／366 nm 紫外光管，400～750 nm 白光管）；CQ－250A－ST型超聲波清洗機（四川中浪科技有限公司）。

1.2 試藥

乳香對照藥材（批號為120970－201305，規格為0.5 g），沒藥（天然沒藥）對照藥材（批號為 120967－201405，規格為1 g），蘇木對照藥材（批號為121067－201606，規格為1 g），續斷對照藥材（批號為 121－33－201311，規格為2 g），均購自中國食品藥品檢定研究院；烏頭堿對照品（批號為150325，規格為20 mg），次烏頭堿對照品（批號為150811，規格為20 mg，），新烏頭堿對照品（批號為150913，規格為20 mg），均購自四川省維克奇生物科技有限公司，上述對照品經高效液相色譜（HPLC）法測定含量均不低于98%；三氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20160803，規格為每瓶0.5 L）等試劑均為分析純；硅膠G和硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠，規格為100 mm×100 mm）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別[1－5]

參照2015年版《中國藥典（四部）》通則2001“顯微鑒別法”，取乳沒活絡散，按粉末制片法制片后置顯微鏡下觀察，結果見圖1。淀粉粒眾多，網紋、梯紋導管，草酸鈣簇晶，木栓細胞長方形或多角形（三七）；不規則團塊，無色或淡黃色，表面及周圍擴散出眾多細小顆粒（乳香）；不規則碎塊，淡黃色半透明滲出油滴（沒藥）；石細胞呈長方形或類長方形，直徑40～120μm（制川烏和制草烏）；體壁碎片上有短粗或細長剛毛（土鱉蟲）。

2.2 薄層色譜鑒別

乳香[1，6－10]：取乳沒活絡散 3 g，加無水乙醇 15 mL，超聲處理15 min，濾過，水浴濃縮至2 mL，作為供試品溶液；另取缺乳香的陰性制劑，同法制備陰性對照品溶液；再取乳香對照藥材適量，同法處理，制得對照藥材溶液。分別吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）－甲苯－乙酸乙酯（10 ∶1.5 ∶1.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 1%的香草醛硫酸溶液（以60%硫酸水溶液作為溶劑），在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果斑點清晰，比移（Rf）值適中。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2 A。

蘇木[1，9－10]：取乳沒活絡散 1 g，置索式提取器中，加乙醚適量加熱回流除去脂溶性成分，藥渣揮干乙醚，再加甲醇適量，加熱回流提取1 h，甲醇提取液揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取缺蘇木的陰性制劑，同法制備陰性對照品溶液；再取蘇木對照藥材0.5 g，同法處理，制得對照藥材溶液。分別吸取上述供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，對照藥材溶液5μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷－丙酮 －甲酸（8∶4 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，分別置日光和紫外光燈（254 nm）下視檢，室溫放置12 h后日光下再次檢視。結果室溫放置12 h后色譜斑點顯色清晰，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2 B。

續斷[1，11－13]：取乳沒活絡散 0.5 g，加甲醇適量，超聲處理25 min，濾過，濾液蒸至近干，殘渣加水20 mL使溶解，濾過，濾液加濃氨水5 mL，再加水飽和的正丁醇提取3次，每次15 mL，合并上層溶液，加正丁醇飽和的水洗滌3次，每次15 mL，合并上層溶液，蒸至近干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺蘇木的陰性制劑0.5 g，同法制備陰性對照品溶液，再取續斷對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。分別吸取對照藥材溶液2μL，供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－醋酸－水（4∶1∶5）10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃ 加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2 C。

圖2 薄層色譜圖

2.3 雙酯型生物堿限量檢查[1，13－14]

生川烏和生草烏中含有以烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿為主的毒性成分雙酯型生物堿，經炮制后水解為毒性較低的單酯型生物堿。為控制乳沒活絡散質量，本研究中對制劑中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的限量檢查進行了研究。

取乳沒活絡散10 g，加氨試液20 mL拌勻，放置1 h，加三氯甲烷100 mL，加濃氨水4 mL，超聲處理30 min，濾過，殘渣和濾器用適量三氯甲烷洗滌，洗滌液與濾液合并，分取三氯甲烷層，置分液漏斗中，用5% 鹽酸溶液提取3次，每次20 mL，合并上層溶液，用濃氨水調節pH至11～12，用三氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并下層溶液，回收至干，殘渣加甲醇溶解成1 mL，作為供試品溶液；取缺制川烏、制草烏的陰性制劑，同法制備陰性對照品溶液；取缺制川烏、制草烏的陰性制劑，分別加入烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿對照品適量，同法制備陰性對照品溶液加混合對照品溶液。再取烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿對照品適量，用0.1%甲酸甲醇溶液溶解，制成 0.48，0.24，0.12 g／L 3種質量濃度的混合對照品溶液。分別吸取供試品溶液10μL和3種質量濃度的混合對照品溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷 －乙酸乙酯 －甲醇（3.2∶1.8∶1）為展開劑，置氨蒸氣飽和30 min的展開缸內展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，在日光下檢視。結果陰性對照無干擾，質量濃度為0.48，0.24 g／L的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿顯色清晰，質量濃度為0.12 g／L的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿顯色不明顯，表明本方法檢測烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿檢出限為1.2μg（0.24 g／L對照品溶液點樣5μL），詳見圖3。

圖3 雙酯型生物堿限量確定薄層色譜圖

吸取上述質量濃度為0.24 g／L對照品溶液5μL，供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，同法展開顯色。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上出現的斑點應小于對照品溶液的斑點或不出現斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖4。

圖4 雙酯型生物堿限量檢查薄層色譜圖

3 討論

乳香鑒別試驗中，分別以石油醚（60～90℃）－甲苯－乙酸乙酯（10∶1.5∶1.5）、石油醚－甲苯 －乙酸乙酯（10∶1.5∶1）及石油醚（60～90℃）－甲苯 －乙酸乙酯（10∶1.5∶0.5）為展開劑，結果以石油醚（60～90℃）－甲苯－乙酸乙酯（10∶1.5∶1）為展開劑時展開效果較好，斑點清晰，Rf值適中，故試驗中選用以其為展開劑。

雙酯型生物堿的限量檢查中，發現烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在甲醇中穩定性較差，混合對照品溶液在含0.1%甲酸的甲醇溶液中穩定性較好。

乳沒活絡散中制川烏和制草烏占全方的6%，2015年版《中國藥典（一部）》制川烏和制草烏項下規定，雙酯型生物堿以烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的總量計，均不得超過0.04%。因此，10 g制劑中雙酯型生物堿以烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿總量不得超過0.24 mg（10 g×6% ×0.04% ＝0.24 mg，經供試品溶液制備后，3種生物堿均為0.24 g／L）。為保證制劑的安全性，供試品中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在薄層色譜上的斑點不得比0.24 g／L對照品溶液點樣5μL的斑點深（即10 g烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的限量不高于 0.24 mg）。