皂素處理聯合MALDI-TOF MS直接鑒定血培養陽性病原菌*

張 蓓，趙麗娜，韓清珍，毛菊珍，張有濤，張險峰，何 軍，徐 杰，史進方

(蘇州大學附屬第一醫院臨床檢測中心，江蘇蘇州 215006)

近年來，經驗性廣譜抗菌藥物的使用和侵入性診療等危險因素的增多，使血流感染日益成為患者院內致殘和致死的主要病因[1-2]。充分利用先進的微生物鑒定儀以縮短血流感染鑒定時間，指導臨床及時開展病原菌針對性治療使患者預后良好具有重要意義[3-6]。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)因能準確、快速地檢測血培養中病原菌而在微生物實驗室廣泛使用[7-9]。與傳統鑒定方法比較，直接鑒定陽性血培養有利于敗血癥患者得到更早、更有效的治療[10-13]。本研究采用皂素處理陽性血培養液，使病原菌富集并純化，然后利用MALDI-TOF MS對病原菌蛋白譜圖進行鑒定分析，同時報道陽性的血培養瓶進行傳統培養流程，培養的純菌落也使用MALDI-TOF MS進行鑒定，若兩者結果不一致，以后者為準。

1 材料與方法

1.1一般材料 收集2016年11月至2017年1月蘇州大學附屬第一醫院240例血培養儀器報警患者(388例陽性儀器報警血培養瓶)標本，標本類型包括全血、靜脈導管血。

1.2儀器與試劑 Bact/ALERT?3D 全自動血培養儀及其配套的血培養需氧微生物培養瓶(SA)和厭氧兼性厭氧微生物培養瓶(SN)均購自梅里埃(中國)公司。 48孔靶板和α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)(α-氰基-4-羥基肉桂酸)基質液購自梅里埃(中國)公司。皂素、甲酸和乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司。質控校準菌株ATCC 8739由梅里埃(中國)公司提供。

1.3皂素提取法MALDI-TOF MS直接鑒定 生物安全柜內操作，采用2 mL無菌注射器提取800 μL儀器報警血培養液于含500 μL 4%皂素的1.5 mL離心管中顛倒混勻，室溫放置3～5 min；10 000 r/min離心2 min，棄上清液；加入600 μL 0.9%生理鹽水重懸沉淀，取1滴懸液涂片革蘭染色鏡檢；再次10 000 r/min離心2 min，棄上清液；加入60 μL 70%甲酸(現用現配)，微量加樣槍重懸混勻沉淀，室溫放置3～5 min；加入60 μL乙腈，顛倒混勻，室溫放置3～5 min，提取菌體蛋白；10 000 r/m離心2 min；吸取2 μL上清液加至Vitek MS 金屬靶板孔，每個標本重復2孔，室溫干燥；每孔加0.9 μL CHCA基質液，室溫干燥。根據革蘭染色涂片結果選擇細菌和真菌進行質譜分析。

1.4血培養直接涂片與皂素處理后涂片染色鏡檢 (1)直接涂片染色鏡檢：從血培養儀中取出報警血培養瓶，涂片革蘭染色鏡檢，記錄是否存在微生物及其革蘭染色性和菌體形態。(2)皂素處理后涂片染色鏡檢：取1滴皂素裂解紅細胞處理后0.9%生理鹽水重懸菌液涂片革蘭染色鏡檢。

1.5傳統血培養MALDI-TOF MS鑒定 血培養陽性標本轉種于血瓊脂平板，適宜環境中孵育18～72 h，若初次培養未見細菌生長，72 h后再次轉種血培養陽性標本；挑取單菌落，涂布金屬靶板孔中，采用Vitek MS微生物質譜鑒定系統進行鑒定。

2 結 果

2.1血培養直接涂片與皂素處理后涂片染色鏡檢結果比較 血培養直接涂片存在大量紅細胞背景，存在難以區分革蘭陰性桿菌與血細胞背景，以及過度染色、脫色等問題。皂素處理后涂片染色鏡檢時，鏡下觀察背景清晰，干擾較少，細菌革蘭染色性和菌體形態典型，很容易找到革蘭陰性桿菌。見圖1。

注：A表示念珠菌；B表示陽性桿菌；C表示鏈球菌；D表示陽性球菌；E表示陰性桿菌

圖1直接涂片與皂素處理涂片鏡檢圖片比較

2.2皂素處理-質譜法直接鑒定血培養的微生物結果

2.2.1單菌株血培養共193例(剔除同一患者多例標本)，標本皂素處理-質譜法直接鑒定的符合率為69.9%(135/193)。革蘭陰性桿菌的符合率為84.0%(63/75)，錯誤率為4.0%(3/75)。葡萄球菌屬的符合率為78.5%(51/65)，錯誤率為6.2%(4/65)。腸球菌屬的符合率為80.0%(8/10)，錯誤率為10.0%(1/10)。鏈球菌屬的符合率為23.1%(3/13)，錯誤率為23.1%(3/13),未鑒定率為53.8%(7/13)。陽性桿菌的符合率為11.8%(2/17)，未鑒定率為82.4%(14/17)。念珠菌屬的符合率為66.7%(4/6)；厭氧菌的符合率為100.0%(3/3)。見表1。

表1 單菌株血培養病原菌鑒定結果[n(%)或n]

續表1 單菌株血培養病原菌鑒定結果[n(%)或n]

2.2.2多菌株陽性血培養瓶共4例(剔除同一患者多例標本)，僅有2例鑒定出其中的1種病原菌；2例未鑒定出病原菌。

2.2.3240例儀器報警血培養瓶中有43例是培養陰性的標本，有37例鑒定結果與血培養結果一致，符合率為86.0%(37/42);其余6例鑒定為少見菌：堪薩斯分枝桿菌2例、格氏李斯特菌1例、玫瑰色庫克菌1例、彎曲乳桿菌1例、生孢梭菌1例。

3 討 論

本研究采用皂素裂解血培養瓶中紅細胞及其他操作步驟進行富集并純化菌體蛋白質，排除因血培養瓶中除有細菌外，還有人體血細胞、肉湯營養成分甚至樹脂等干擾因素對后續質譜結果的影響[14]。與此法類似的有Sepsityper 配套試劑盒，但是成本昂貴[15-16]。

本研究結果表明，皂素處理-質譜法在單菌株陽性瓶革蘭陰性桿菌、葡萄球菌屬、腸球菌屬、厭氧菌的鑒定符合率達75.0%以上，而且其相對于傳統的培養鑒定流程可提前1～2 d鑒定結果，可以在血培養儀器報警的1～2 h內將病原菌鑒定結果報告臨床。有研究報道，有效的抗菌藥物治療每延遲1 h，感染性休克患者出現低血壓后的存活率平均下降7.6%，所以該方法對血流感染患者的治療意義重大[3]。本方法鑒定符合率(69.9%)與分離膠促凝管聯合MALDI-TOF MS方法的鑒定符合率(73.6%)基本一致，說明本研究方法的可行性[17]。但是還存在一些不足，鏈球菌屬與陽性桿菌的鑒定符合率明顯低于其他病原菌的鑒定，李媛睿等[18]對可能原因進行了分析：(1)革蘭陽性球菌細胞壁結構相對較厚，不易裂解，提取的核糖體蛋白濃度不夠。(2)蛋白結構高度相似，特征性峰譜較少，質譜難以區分。(3)生長緩慢，核糖體蛋白未充分表達。(4)菌體形態小，未能提取足夠的蛋白。(5)某些患者血細胞壓積過高，使抽取的血培養液的含量與皂素含量未達到一定比例，因此紅細胞裂解不充分，干擾了鑒定結果。本研究更傾向于MALDI-TOF MS，由于其本身對鏈球菌屬與陽性桿菌的數據庫并不完善，限制了其鑒定。多菌株感染血培養瓶中，有2例鑒定出其中的1種病原菌；2例未鑒定出病原菌；雖然可以鑒定出其中1種，但是其鑒定率不高，復合菌均鑒定的比率更低，原因可能為2種菌體的核糖體蛋白互相干擾[19]。43例假陽性血培養瓶中，37例與傳統鑒定結果一致，6例用皂素提取法聯合MALDI-TOF MS鑒定出細菌，種類有堪薩斯分枝桿菌2例、格氏李斯特菌1例、玫瑰色庫克菌1例、彎曲乳桿菌1例、生孢梭菌1例。這些細菌大多在自然環境和水中廣泛存在，可能在操作過程中污染了這些菌，也可能是血培養瓶在抽取血液時被這些菌污染，由于數量少，傳統鑒定方法未能鑒定出，因而出現結果不一致。所以，對鑒定出來的結果，還要參考革蘭染色鏡檢結果進行綜合評價。

與傳統鑒定方法相比，皂素預先處理與MALDI-TOF MS聯合有以下優點：(1)直接提取，操作簡便。(2)檢測快速，周轉時間短，每份標本約為15～20 min。(3)鑒定范圍廣，基本涵蓋臨床常見病原菌。(4)結合革蘭染色鏡檢結果，對臨床治療有重要的提示意義。有待改進的地方：(1)鏈球菌和陽性桿菌的鑒定率不高。(2)鑒定易受標本血細胞壓積過高的干擾，可適當減少血培養液含量。(3)慢生長的細菌，存在菌含量不夠的限制，菌量至少達到106CFU/mL才能獲得較好的質譜峰[20]。

綜上所述，采用皂素處理聯合MALDI-TOF MS能快速、簡便、準確地鑒定血培養的常見病原菌，且成本低廉，可行性高，適合在臨床微生物實驗室推廣應用；同時滿足臨床對血流感染病原菌快速診斷的需求，臨床醫師可結合該院耐藥性檢測數據，及時對血流感染患者給予早期且有效的抗菌藥物治療，從而降低患者的院內致殘率和致死率。