血清乙型肝炎病毒大蛋白對乙型肝炎病毒感染者的檢測意義

高嫣妮，李筱莉，崔兆磊，陳巖松，葉 倩，陳 燕

(福建省腫瘤醫院檢驗科/福建醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科/福建省腫瘤生物治療重點實驗室，福州 350014)

乙型肝炎病毒(HBV)感染在我國屬于危害較重的傳染性疾病之一。用傳統“兩對半”指標的HBsAg和HBeAg不能充分反映HBV病毒感染及其療效，存在很大的局限性。HBeAg陰性的活動期肝炎患者越來越多，部分HBeAg陰性患者病毒仍大量復制，目前認為可能是免疫清除不全或HBV前C區末端發生變異而引起，該類常為慢性乙型肝炎患者，更易發生肝硬化及肝癌，預后較差[1-2]。由于HBV-DNA早于HBV其他血清標志物出現，因此HBV-DNA陽性常被臨床認為是判斷HBV復制及感染的金標準。但HBV-DNA并不能完全反映靜息期肝細胞HBV復制情況，且HBV-DNA檢測成本高、技術難度大、操作復雜、影響因素較多，質量控制嚴格，故其檢測難以廣泛普及。現對HBV感染者進行血清乙型肝炎病毒大蛋白(HBV-LP)、HBV-DNA、HBV-M及肝功能等指標檢測，分析與其他指標的相關性，探討HBV-LP用于HBV感染者HBV復制程度和療效監測的可靠性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年7月至2016年12月福建省腫瘤醫院收治的283例HBV感染者作為觀察組，診斷標準符合第十次全國傳染病與寄生蟲病學會和肝病學分會聯合修訂的《病毒性肝炎防治方案》中乙型肝炎病原學診斷標準。其中男179例，女104例，平均年齡(50.4±13.1)歲。選取同期60例健康體檢者作為對照組。2組研究對象留取血清標本4 mL，―80 ℃凍存備用。本研究獲得福建省腫瘤醫院倫理委員會的批準和受檢者的知情同意。

1.2儀器與試劑 HBV-LP酶聯免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測試劑盒(北京熱景生物技術有限公司)，HBV-DNA檢測試劑盒(廣州中山達安基因有限公司)。ABI7500實時熒光定量PCR分析儀，安圖酶標儀；HBV-M 檢測試劑盒(英科新創科技有限公司)，帝肯酶免自動分析儀；肝功能檢測試劑盒(貝克曼庫爾特有限公司)，羅氏P800生化分析儀。所用試劑均在其有效期內。

1.3方法 HBV-M、HBV-LP測定均采用ELISA法，陽性判斷標準：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBV-LP為S/CO≥1為陽性；HBeAb、HBcAb 為S/CO≤1為陽性。HBV-DNA定量測定采用熒光定量(PCR)法，其含量≥500 copy為陽性。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)采用化學發光法；實驗所有操作均嚴格按試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.12組研究對象HBV-LP與HBV-DNA檢出率結果比較 觀察組HBV-LP檢出率為70.7%(200/283)，HBV-DNA檢出率為56.5%(160/283)，HBV-LP和HBV-DNA總檢出率為79.9%(226/283)，而HBeAg檢出率僅為15.5%(44/283)。血清HBV-LP與HBV-DNA的陽性符合率為47.3%(134/283)，陰性符合率為20.1%(57/283)，總符合率為67.5%(191/283)。對照組血清HBV-LP與HBV-DNA的檢出率均為0。

2.2觀察組HBV-LP與HBV-DNA、肝功能指標的相關性 HBV-LP各孔(S/CO)值與HBV-DNA含量(r=0.464，P=0.000)及HBV-DNA拷貝數均呈正相關(r=0.402，P=0.000)。HBV-LP陽性患者的ALT、AST、AFP水平均高于HBV-LP陰性患者(均P<0.05)。Spearman相關分析顯示，HBV-LP與ALT、AST、AFP含量均呈正相關(P<0.05)。HBV-DNA中等程度復制組(103～106copy/mL)和高復制組(≥106copy/mL)之間，HBV-LP表達量差異有統計學意義(P<0.05)。見表1和圖1、2。

表1 HBV-DNA含量與HBV-LP(S/CO)值的相關性

圖1 HBV-DNA含量與HBV-LP的相關性

2.3不同模式的HBV-LP和HBV-DNA檢出率結果比較

2.3.1“兩對半”常見模式的HBV-LP和HBV-DNA檢測結果比較 37例大三陽(HBsAg、HBeAg、HBcAb均陽性)患者的HBV-LP檢出率為100.0%(37/37)，而HBV-DNA檢出率為91.9%(34/37)，兩者比較差異無統計學意義(P=0.240)。219例小三陽(HBsAg、HBeAb、HBcAb均陽性) 患者的HBV-LP檢出率為66.2%(145/219)，HBV-DNA檢出率為50.2% (110/219)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=11.498，P=0.001)(其他“兩對半”模式數量較少，未作統計)。見表2。

圖2 HBV-DNA拷貝數與HBV-LP的相關性表2 “兩對半”常見模式HBV-LP與 HBV-DNA檢出率結果比較[%(n/n)]

類別例數(n)HBV-LP檢出率HBV-DNA檢出率P大三陽37100.0(37/37)91.9(34/37)0.240小三陽21966.2(145/219)50.2(110/219)0.001

2.3.2HBeAg與HBeAb陽性和陰性患者HBV-LP及HBV-DNA檢出率結果比較 44例HBeAg陽性患者HBV-LP和HBV-DNA的檢出率比較，差異無統計學意義(P=0.241)，陽性符合率達93.2%。239例HBeAg陰性患者的HBV-LP和HBV-DNA檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=11.722，P=0.001)，陽性符合率為38.9%(93/239)。HBeAg陰性但HBV-DNA陽性患者的HBV-LP陽性率為78.2%(93/119)，HBeAg陰性患者有59.6%(93/156)為HBV-LP陽性而HBV-DNA陰性。226例HBeAb陽性的HBV感染者HBV-LP和HBV-DNA檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=11.248，P=0.001)。57例HBeAb陰性的HBV感染者HBV-LP和HBV-DNA檢出率比較，差異無統計學意義(χ2=1.363，P=0.243)。見表3。

表3 不同血清標志物模式的HBV-LP與 HBV-DNA檢出率結果比較[%(n/n)]

3 討 論

HBV-LP是HBV病毒的包膜蛋白，空間上具有2種不同跨膜結構，其外側能與易感細胞受體結合，內側能與HBV核殼體膜結合。HBV-LP包括表面抗原和前S蛋白，PreS1蛋白和PreS2蛋白是HBV Dane氏顆粒和亞病毒顆粒的主要包膜。HBV病毒感染、復制、預后過程中，HBV-LP起著至關重要的作用[2-3]。

本研究結果表明，HBV-LP在HBV感染血清中較HBV-DNA、HBeAg更敏感，HBV-LP檢出率顯著高于HBV-DNA、HBeAg。ELISA法檢測HBV-LP相對表達量與HBV-DNA含量及拷貝數之間均存在良好的正相關性，提示HBV-LP表達與病毒的復制密切相關。本研究26例HBV-LP陰性而HBV-DNA陽性標本，可能與PCR技術的高靈敏度有關[4]。還有66例HBV-DNA陰性而HBV-LP陽性標本，與HBV-LP的生物學機制密切相關。原因如下，(1)HBV-LP具有雙重跨膜拓撲結構：HBV-LP較早釋放進入血液，感染早期可作為受體蛋白與細胞受體結合介導病毒粒子的細胞內攝入；在感染中后期則明顯增加參與病毒粒子的組裝和分泌；其前S區的拓撲結構還可反式激活細胞內病毒的復制等[5-7]。(2)HBV-LP存在超量表達：有研究以鴨乙型肝炎為模型證實亞病毒顆粒能夠反式激活病毒，使病毒復制重新激活，能顯著增強細胞內的病毒復制和基因表達[8]。這種增強作用提示HBV的血清感染性不僅依賴于感染性病毒Dane 顆粒的數量，還與富含HBV-LP的亞病毒顆粒的數目緊密相關。(3)單抗特異識別檢測HBV-LP：機體免疫壓力和藥物壓力等因素，使HBV基因組的前C區和核心啟動子變異頻繁，HBeAg轉陰但病毒仍然復制，因此HBeAg陰性的乙型肝炎感染流行率呈不斷升高趨勢；而已設計好的商品化PCR引物有一定的漏檢率；然而本研究使用包被針對立體構象型表位的單克隆抗體檢測HBV-LP，受基因變異的影響較少。(4)HBV-LP消失晚于HBV-DNA[9]：HBV-LP反式激活作用與cccDNA再復制密切相關。由于抗病毒藥物(如核苷類)只能抑制肝臟內病毒cccDNA的復制，而不可抑制已形成的病毒表達蛋白，不能減少前基因組RNA及mRNA，即以病毒DNA為模板的轉錄和病毒蛋白的翻譯表達不受影響，病毒在一段時間內持續分泌不含DNA的空粒。同時外周血中有亞病毒粒數目約為Dane粒的1萬倍，故HBV-LP消除需要一定的半衰期，減退比HBV-DNA晚。對該類患者，肝臟cccDNA的降低程度遠低于血清中HBV-DNA降低水平，肝臟cccDNA仍然較多存在，臨床出現抗病毒治療后患者HBV-DNA 已陰轉、HBeAg發生血清轉換，而HBV-LP仍在一段時間內存在。

本研究結果顯示，HBeAg陰性而HBeAb陽性患者HBV-LP與HBV-DNA檢出率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，且不同HBV-M模式下，HBV-DNA和HBV-LP 的檢出率不同。分析2種常見“兩對半”模式，由于本研究肝癌或肝硬化患者較多，因此小三陽居多。小三陽患者HBV-DNA與HBV-LP檢出率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，小三陽HBV感染者檢測HBV-LP，能更準確地判斷患者HBV復制情況。本研究結果顯示，HBV-LP在對照組血清中未能檢測到，提示只有HBV攜帶者或HBV患者才能檢測到HBV-LP。另外，本研究通過對所選標本的肝功能分析發現，HBV-LP陽性患者的ALT、AST水平高于HBV-LP陰性患者，由于ALT及AST是反映肝細胞損傷極為靈敏的指標，HBV-LP與ALT、AST、AFP含量均呈正相關關系，提示HBV-LP表達與肝細胞損傷有關，可能與直接的肝細胞毒性及HBV的活動性相關。

HBV-LP陰性或許可作為抗病毒治療終點的輔助指標之一，對指導臨床治療具有較高的應用價值。GRIPON等[10]研究發現，源于大蛋白的乙酰化肽段能使肝細胞表面的受體失活，切斷病毒感染其他肝細胞的途徑。只有當血清HBV-DNA和HBV-LP均檢測不到時，說明病毒核酸復制、外膜蛋白的表達均處于停止狀態，提示抗病毒治療達到較為理想的目標，可較好地避免HBV-DNA病毒變異陰轉之后，造成漏檢，導致患者病情出現反復[11-12]。有研究表明，HBV感染肝細胞合成的大蛋白數量遠超過病毒形態發生所需數量，在缺少病毒核衣殼的條件下，最終形成球狀或纖維狀的空的亞病毒顆粒(SPVS)，其在細胞內積累可導致肝細胞液泡化和細胞凋亡[13]。提示HBV-LP含量的連續檢測有利于對慢性HBV預后的監測，防止或延緩肝硬化或肝癌的發生與發展。

綜上所述，由于HBV-LP是導致肝臟細胞損傷、病變及死亡的主要原因之一，且能反式激活HBV病毒，促進其復制，因此HBV-LP是能夠很好地反映患者的病毒復制、肝細胞損傷、疾病進程、療效與預后判斷的新的靈敏監測指標。HBV-LP采用ELISA法檢測比HBV-DNA采用PCR定量檢測的實驗室環境和條件要求均低，其檢測簡單、快速，可作為“兩對半”檢測的補充，特別適合各級醫院、各類人群作為常規檢查項目。當然，考慮到各項指標并非完全一致， HBV-LP與HBV-DNA、乙型肝炎“兩對半”和肝功能聯合檢測，將會更全面地反映HBV感染患者血清的病毒復制及感染狀態，對患者的抗病毒治療，以及臨床療效、預后觀察具有指導性作用，促進患者HBV清除和慢性肝性疾病康復。