兩種桃金娘科不同屬植物葉揮發(fā)油成分GC-MS分析及其抗肺癌A549、H460細(xì)胞增殖活性

李武國(guó),蘇 喬,*,魏潔書,梁綺文,劉翠婷,朱燁妍,趙廣銀,李雯雯,黃浩機(jī),李文英,曹偉杰,詹若挺

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,廣東廣州 510080;2.中山大學(xué)新華學(xué)院,廣東廣州 510520;3.南方醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510515;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心/嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510006)

蓮霧(SyzygiumsamarangenseMerr. et Perry),又稱洋蒲桃、水蒲桃等,為桃金娘科蒲桃屬熱帶常綠小喬木,原產(chǎn)于馬來(lái)半島、安達(dá)曼群島。在馬來(lái)西亞、印尼、菲律賓以及我國(guó)臺(tái)灣、廣東、福建南部、廣西等地普遍栽培。蓮霧性平味甘,具有一定的保健治療功能,能潤(rùn)肺、止咳、除痰、涼血、收斂,可治肺燥咳嗽等[1]。蓮霧葉、花與果實(shí)含有豐富的油腺,可提取芳香油。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于蓮霧葉、花與果實(shí)的揮發(fā)性成分分析均有文獻(xiàn)報(bào)道[2-6],其中,李海泉等[2]利用超臨界CO2萃取獲得了蓮霧葉精油,并進(jìn)行了成分分析。但是蓮霧葉揮發(fā)油的體外生物活性卻鮮有報(bào)道。利用水蒸氣蒸餾法提取獲得的蓮霧葉揮發(fā)油與超臨界CO2萃取獲得的蓮霧葉精油化學(xué)成分是否一致,這有待于進(jìn)一步的研究。

白千層(MelaleucaleucadendronL.),桃金娘科白千層屬喬木,又名千層皮、脫皮樹(shù)、玉蝴蝶、玉樹(shù)等,原產(chǎn)澳大利亞,我國(guó)海南、廣東、福建、廣西、臺(tái)灣均有分布,其精油具有鎮(zhèn)痛、驅(qū)蟲及防腐等功效,可治耳痛、牙痛、風(fēng)濕痛及神經(jīng)痛等[7]。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于白千層揮發(fā)油的化學(xué)成分分析的文獻(xiàn)早有報(bào)道,但多集中于對(duì)其枝葉、果實(shí)揮發(fā)油及其抗菌活性的研究[8-14]。廖子堅(jiān)等[15]比較分析了超臨界CO2萃取與水蒸氣蒸餾互葉白千層揮發(fā)油的化學(xué)成分,發(fā)現(xiàn)兩種提取方法得到的揮發(fā)油化學(xué)成分有較大差異。白千層枝葉揮發(fā)油是一種優(yōu)良的天然抗菌劑,具有很好的開(kāi)發(fā)前景,但其在其它生物活性方面的應(yīng)用則有待探究。

蓮霧、白千層同屬于桃金娘科,但其葉揮發(fā)油的化學(xué)成分以及抑制人肺癌A549、H460細(xì)胞增殖活性是否一致有待于探究。本研究通過(guò)水蒸氣蒸餾法分別提取蓮霧葉、白千層葉中的揮發(fā)油,通過(guò) GC-MS分析和鑒定這兩種揮發(fā)油的化學(xué)組成,并對(duì)比分析其化合物種類和質(zhì)量百分含量的異同,同時(shí)采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測(cè)定了蓮霧葉、白千層葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌A549、H460細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制活性,為蓮霧葉、白千層葉揮發(fā)油的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肺癌A549、H460細(xì)胞 由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所李文德研究員贈(zèng)送;蓮霧葉、白千層葉 均采自中山大學(xué)北校園,陰干備用,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心詹若挺研究員分別鑒定為桃金娘科蒲桃屬蓮霧SyzygiumsamarangenseMerr. et Perry干燥葉、桃金娘科白千層屬白千層MelaleucaleucadendronL.干燥葉;蓮霧干燥葉(QW10201)、白千層干燥葉(QW10301)標(biāo)本 保存于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;胎牛血清(批號(hào):42G5550K)、DMEM培養(yǎng)基(批號(hào):8117108)、Pen Strep(青鏈霉素)(批號(hào):1881450)、0.25% Trypsin-EDTA(0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸)(批號(hào):1676922)、PBS(磷酸鹽緩沖液;pH為7.4)溶液(批號(hào):8117157) 美國(guó)Gibco公司;MTT(四甲基偶氮唑鹽)粉末(批號(hào):3580GR001) 德國(guó)Biofroxx公司;DMSO(二甲基亞砜)(批號(hào)：20170724) 天津市大茂化學(xué)試劑廠。

Class Ⅱ BSC型生物安全柜 新加坡ESCO公司;BIOFUGE PRIMO R型離心機(jī)、HERACELL 150i型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;ZW-A型微量振蕩器 江蘇科析儀器有限公司;Voyager型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有NIST Search 2.0質(zhì)譜檢索庫(kù)、TG WAXMSTG石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 美國(guó)Finnigan公司;98-Ⅰ-B型電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司;1000 mL型揮發(fā)油提取器 北京博美華科玻璃有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蓮霧葉、白千層葉揮發(fā)油的提取 將蓮霧干燥葉、白千層干燥葉剪碎,分別稱取200 g蓮霧干燥葉、白千層干燥葉于揮發(fā)油提取器中,加6倍水浸泡1 h后蒸餾6 h,收集揮發(fā)油,干燥,稱重,計(jì)算得率。得率(%)=揮發(fā)油質(zhì)量/葉質(zhì)量×100。

1.2.2 氣相色譜條件 TG WAXMSTG石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升溫:初始溫度40 ℃,保持3 min,以6 ℃/min升至130 ℃,以2 ℃/min升至210 ℃,以20 ℃/min升至300 ℃;進(jìn)樣口溫度270 ℃;載氣為高純氦氣,載氣流速1 mL/min,恒流模式;分流進(jìn)樣,分流比20∶1,進(jìn)樣量0.1 μL。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源溫度為230 ℃;電離方式為電子轟擊(EI)源,電子轟擊能量為70 eV;ACQ方式為Full Scan,掃描速度為2200.19 amu/s,掃描質(zhì)量范圍為m/z 33～450,溶劑延遲時(shí)間為3 min。

1.2.4 揮發(fā)性成分相對(duì)含量計(jì)算 各化學(xué)成分通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)NIST Search 2.0進(jìn)行檢索匹配,人工解析質(zhì)譜并確證化合物的結(jié)構(gòu),采用峰面積歸一法計(jì)算分離鑒定化學(xué)成分的相對(duì)百分含量。

1.2.5 蓮霧葉、白千層葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460細(xì)胞增殖能力的影響 通過(guò)MTT法[16-17]評(píng)價(jià)蓮霧葉、白千層葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460細(xì)胞增殖能力的影響。體外培養(yǎng)人肺癌A549、H460細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集細(xì)胞,消化后計(jì)數(shù),在96孔板中每孔分別加入約3000、2500個(gè)細(xì)胞,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞接種于96孔板24 h后,吸棄各孔中的培養(yǎng)液,空白對(duì)照組每孔加入100 μL含0.4% DMSO和10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,給藥組每孔分別加入100 μL含10% FBS和不同濃度(0、1、5、10、20、40、60、80、100和120 mg/L)的蓮霧葉、白千層葉揮發(fā)油的DMEM培養(yǎng)液,每組平行設(shè)置3個(gè)孔,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,每孔加入20 μL 5 g/L MTT,培養(yǎng)4 h,吸棄培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min。酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定OD值。OD值用于計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力,細(xì)胞相對(duì)活力=給藥組OD值/空白對(duì)照組OD值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分析方法為單因素方差分析。p<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮霧葉揮發(fā)油的提取及GC-MS分析

水蒸氣蒸餾法提取蓮霧干燥葉200 g,獲得0.4 g揮發(fā)油,得率分別為0.2%。對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分離分析,得總離子流圖,見(jiàn)圖1。

圖1 蓮霧葉揮發(fā)油的總離子流圖

蓮霧葉揮發(fā)油總離子流圖中的各峰經(jīng)過(guò)NIST Search 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,并經(jīng)人工逐一核對(duì)解析質(zhì)譜圖,確認(rèn)化合物結(jié)構(gòu),采用面積歸一化法計(jì)算各譜峰化合物的相對(duì)百分含量,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蓮霧葉揮發(fā)油GC-MS分析

蓮霧葉揮發(fā)油總離子流圖中,共分離獲得54個(gè)化學(xué)組分峰,其中鑒定確證38種化合物,占總檢測(cè)到化學(xué)成分相對(duì)百分含量的94.52%,含量較高的化合物是石竹烯(16.91%)、à-芹子烯(16.33%)、β-桉葉烯(15.43%)、(+)-δ-杜松烯(7.07%)和藍(lán)桉醇(6.54%)等,其相對(duì)含量之和為62.28%。其中石竹烯相對(duì)含量最高,是蓮霧葉揮發(fā)油的主要化學(xué)成分之一。與李海泉等[2]利用超臨界CO2萃取獲得的蓮霧葉精油的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比,超臨界CO2萃取的蓮霧葉精油含有更多的化學(xué)組分峰(79個(gè)),但是只鑒定了36種化合物,相對(duì)含量較高的五個(gè)化合物分別為β-石竹烯(14.32%)、δ-杜松烯(11.78%)、τ-杜松醇(8.85%)、γ-杜松烯(5.87%)和α-杜松醇(5.27%),其相對(duì)含量之和為46.09%,該研究的主要化學(xué)成分種類、相對(duì)百分含量均與本研究存在較大的差異,這可能是由于不同的揮發(fā)性成分提取方法造成的。

2.2 白千層葉揮發(fā)油的提取及GC-MS分析

水蒸氣蒸餾法提取白千層干燥葉200 g,獲得3.4 g揮發(fā)油,得率為1.7%。對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分離分析,得總離子流圖,見(jiàn)圖2。

圖2 白千層葉揮發(fā)油的總離子流圖

白千層葉揮發(fā)油總離子流圖中的各峰經(jīng)過(guò)NIST Search 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,并經(jīng)人工逐一核對(duì)解析質(zhì)譜圖,確認(rèn)化合物結(jié)構(gòu),采用面積歸一化法計(jì)算各譜峰化合物的相對(duì)百分含量,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白千層葉揮發(fā)油GC-MS分析

國(guó)內(nèi)關(guān)于白千層葉揮發(fā)油的活性研究主要集中在抗菌方面,而本研究對(duì)白千層葉水蒸氣蒸餾獲得的揮發(fā)油進(jìn)行了GC-MS分析，并利用MTT法對(duì)白千層葉揮發(fā)油進(jìn)行了體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。GC-MS分析結(jié)果顯示,白千層葉揮發(fā)油總離子流圖中,共分離獲得36個(gè)化學(xué)組分峰,其中鑒定確證28種化合物,占總檢測(cè)到化學(xué)成分相對(duì)含量的99.27%,相對(duì)含量較高的化合物是桉樹(shù)腦(47.47%)、()-2,6,6-三甲基雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯(12.64%)、α-松油醇(12.09%)、D-檸檬烯(10.20%)和表藍(lán)桉醇(8.25%)等,其相對(duì)百分含量之和為90.65%。其中桉樹(shù)腦相對(duì)含量最高,是白千層葉揮發(fā)油的主要化學(xué)成分之一。汪燕等[18]研究者采集了華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園里的白千層葉片,利用水蒸氣蒸餾法提取獲得了白千層葉片揮發(fā)油,并進(jìn)行了GC-MS分析,結(jié)果顯示,其主要成分包括桉樹(shù)腦(48.372%)、鳳蝶醇(13.641%)、α-松油醇(10.004%)、蒎烯(6.411%)和檸檬烯(4.881%)等,其相對(duì)百分含量之和為83.309%。雖然白千層葉都采集于廣東省廣州市內(nèi),但是與本研究所獲得的白千層葉揮發(fā)油相比,主要化學(xué)成分及其相對(duì)含量均存在一定的差異,這可能與生長(zhǎng)環(huán)境、采集時(shí)間等有關(guān)。桉樹(shù)腦(又稱為桉油精)，作為白千層葉揮發(fā)油含量最高的化合物,具有抗菌、抗炎、殺蟲、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)透皮吸收等作用[19-20],但馬興苗等[21]利用MTT法評(píng)價(jià)了桉油精對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,結(jié)果表明,桉油精對(duì)上述四種胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)均無(wú)顯著抑制作用。本研究利用MTT法評(píng)價(jià)了白千層葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460的細(xì)胞增殖抑制作用,結(jié)果顯示,白千層葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460均無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制作用。該結(jié)果提示,白千層葉揮發(fā)油的主要成分桉樹(shù)腦對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460很可能無(wú)顯著的生長(zhǎng)抑制作用。

2.3 蓮霧葉揮發(fā)油與白千層葉揮發(fā)油共有化合物對(duì)比分析

對(duì)蓮霧葉和白千層葉揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,可以發(fā)現(xiàn),蓮霧葉揮發(fā)油含有更豐富的揮發(fā)性化合物,鑒定確證的化合物也更多,含量較高的五個(gè)化合物均不相同。兩種揮發(fā)油有13種共有化合物,分別為á-月桂烯、癸烷、1-甲基-3-(1-甲基乙基)苯、D-檸檬烯、異松油烯、5-甲基-2-(1-甲基乙烯基)環(huán)己醇、萜品-4-醇、α-松油醇、à-石竹烯、香橙烯、石竹烯氧化物、庫(kù)貝醇、τ-杜松醇。13種共有化合物相對(duì)保留時(shí)間基本一致,相對(duì)含量均有差別(見(jiàn)表3),其中,D-檸檬烯(蓮霧葉0.70%、白千層葉10.20%)、α-松油醇(蓮霧葉1.24%、白千層葉12.09%)、à-石竹烯(蓮霧葉1.34%、白千層葉0.08%)、香橙烯(蓮霧葉0.43%、白千層葉0.05%)、庫(kù)貝醇(蓮霧葉1.03%、白千層葉0.09%)、τ-杜松醇(蓮霧葉1.12%、白千層葉0.04%)6種化合物的相對(duì)含量差異較大。

表3 蓮霧葉揮發(fā)油與白千層葉揮發(fā)油共有化合物對(duì)比分析

2.4 蓮霧葉、白千層葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460細(xì)胞增殖能力的影響

通過(guò)MTT法評(píng)價(jià)蓮霧葉、白千層葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460細(xì)胞增殖能力的影響。測(cè)試結(jié)果(見(jiàn)圖3)表明,蓮霧葉揮發(fā)油分別對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460作用24 h后,在濃度為40 mg/L時(shí)，對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞增殖能力產(chǎn)生顯著的抑制作用(p<0.05),并呈劑量依賴性,抑制作用隨著濃度的增大而增強(qiáng),其IC50值為49.99 mg/L;在濃度為60 mg/L時(shí)，對(duì)人肺癌細(xì)胞H460的細(xì)胞增殖能力產(chǎn)生極顯著的抑制作用(p<0.001),并呈劑量依賴性,抑制作用隨著濃度的增大而增強(qiáng),其IC50值為65.70 mg/L。各濃度的白千層葉揮發(fā)油(1、5、10、20、40、60、80、100和120 mg/L)分別對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460作用24 h后,細(xì)胞相對(duì)活力與空白對(duì)照組相當(dāng),說(shuō)明白千層葉揮發(fā)油對(duì)A549、H460細(xì)胞無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制作用(p>0.05)。

圖3 蓮霧葉、白千層葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460細(xì)胞增殖能力的影響

3 結(jié)論

本研究通過(guò) GC-MS 分析和鑒定了蓮霧葉揮發(fā)油與白千層葉揮發(fā)油的化學(xué)組成,結(jié)果顯示,雖然蓮霧、白千層同屬于桃金娘科,但其葉揮發(fā)油所含化合物種類、同一化合物相對(duì)含量各不相同。MTT測(cè)試結(jié)果表明,雖然蓮霧葉揮發(fā)油與白千層葉揮發(fā)油含有13個(gè)共有成分,但其對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、H460的細(xì)胞增殖能力所產(chǎn)生的影響存在較大差異。作用24 h后,蓮霧葉揮發(fā)油在濃度為40 mg/L時(shí)，對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞增殖能力產(chǎn)生顯著的抑制作用(p<0.05),在濃度為60 mg/L時(shí)，對(duì)人體癌細(xì)胸H460的細(xì)胞子增殖能力產(chǎn)生極顯著的抑制作用(p<0.001),而濃度等于或小于120 mg/L的白千層葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌A549、H460細(xì)胞均無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制作用(p>0.05)。