甘露糖結合凝集素基因多態性與結核病易感性關系的研究

余亮 譚自明 張斌 趙晶 木哈達斯·吐爾遜依明 李奇鳳 羅新輝 孫荷

摘 要：目的 了解甘露糖結合凝集素基因多態性與新疆喀什地區結核病易感性的關系。方法 選取2015年12月～2017年12月在新疆喀什地區收集肺結核患者193例血液樣本，收集同時期健康體檢人員142例血液樣本，采用試劑盒法提取全血基因組DNA，采用英國LGC公司生產的基于競爭性等位基因特異性PCR（KASP）技術的SNPline基因分型平臺對選定的MBL基因SNP位點rs7096206進行分型，獲得該位點的基因型頻率和等位基因頻率。結果 MBL基因rs7096206位點的三個基因型CC、GC、GG在結核患者組和對照組中的分布，差異無統計學意義（P>0.05），但從等位基因在兩組間的分布上看，突變型堿基G在結核患者組中的頻率高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 MBL基因rs7096206多態性位點與新疆結核病易感性存在關聯，攜帶G堿基比攜帶C堿基具有更高的結核病發病風險。

關鍵詞：甘露糖結合凝集素（MBL）；結核??；基因多態性；新疆

中圖分類號：R521 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.13.019

文章編號：1006-1959（2018）13-0065-03

Abstract：Objective To investigate the relationship between mannose-binding lectin gene polymorphism and susceptibility to tuberculosis in Kashgar，Xinjiang.Methods From December 2015 to December 2017，193 blood samples of pulmonary tuberculosis patients were collected in Kashgar，Xinjiang.142 blood samples were collected from concurrent health checkups.The whole blood genomic DNA was extracted by kit method，and the selected SNP locus rs7096206 was obtained by SNPline genotyping platform based on competitive allele-specific PCR（KASP）technology produced by LGC，UK.Genotypic frequency and allele frequency of this locus. Results There were no significant differences in the distribution of three genotypes CC，GC and GG of MBL gene rs7096206 in tuberculosis patients and control group（P>0.05），but the distribution of alleles between the two groups was observed.The frequency of mutant base G in the tuberculosis group was higher than that in the control group，and the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion The polymorphism of MBL gene rs7096206 is associated with susceptibility to tuberculosis in Xinjiang，and carrying G bases has a higher risk of tuberculosis than carrying C bases.

Key words：Mannose binding lectin（MBL）；Tuberculosis；Gene polymorphism；Xinjiang

結核?。╰uberculosis）是由結核分枝桿菌感染引起的傳染病，據報道，全球超過1/3的人口曾經感染過結核分枝桿菌，但感染過結核分枝桿菌的人群中只有不到10%的人會發展成為活動性結核患者，個體的遺傳因素可能導致結核病易感性的差異，遺傳因素，宿主的基因可能在結核病的發生發展及轉歸中起到至關重要的作用[1]。易感基因在結核病發生發展中的作用越來越受到學者們的關注，甘露糖結合凝集素（MBL）是一種能特異識別糖類并與之共價結合的糖蛋白，廣泛分布于人的肝臟和血液中，通過補體系統參與機體的微生物防御反應及免疫調節反應[2]，人MBL基因位于10號染色體10q11.2區，含有5個外顯子，MBL基因突變可能影響MBL的二級結構，產生無活性的寡聚體，導致血清中的MBL濃度降低，MBL基因多態性可能對結核病的易感性產生影響。

1資料與方法

1.1研究對象 選取2015年12月～2017年12月在新疆喀什地區收集肺結核患者193例為病例組，所有病例確診均嚴格按照中華醫學會結核病學分會制定的《臨床診療指南：結核病分冊》的診斷標準[3]，胸部X線檢查發現肺部組織存在典型的活動性結核病變，肺部病變標本、病理學診斷為結核病變；在患者知情同意的情況下，填寫調查表，調查內容包括患者的性別、年齡、民族、身高、體重、職業、婚姻狀況、學歷、飲酒、吸煙、飲茶、卡介苗接種史的情況等。收集同時期健康體檢人員142例為對照組，性別和年齡與結核患者組相匹配。對照組納入標準為：①X線檢查未發現活動性肺結核病灶、病理性鈣化灶和病理性肺陰影；②無結核病史；③無糖尿病、嚴重心、肝、腎等器質性病變；④與病例組的患者無血緣關系。

1.2方法

1.2.1采用血液樣本 EDTA抗凝管采集研究對象晨起空腹靜脈血3 ml，搖晃后置于冰箱冷藏備用。

1.2.2提取血液DNA 使用天根生化科技有限公司生產的基因組DNA提取試劑盒（血液/細胞/組織）提取全血基因組DNA，按照試劑盒說明書的實驗步驟進行操作：取一支EP管，管中加入300 μl抗凝血，再加入900 μl細胞裂解液A，溫和混勾，12000 rpm離心1 min，小心棄去上清，留下細胞核沉淀；向沉淀中加入600 μl緩沖液B，溫和震蕩混勾，加入10 μl蛋白酶K，顛倒10次混勻（約15 s），65 ℃水浴15～30 min至沉淀完全裂解；將混勻的液體轉入離心柱中，靜置2 min，12000 rpm，離心1 min，棄廢液；再次12000 rpm離心2 min，將離心柱置于新離心管中，并打開離心柱蓋，于室溫放置5～10 min至無明顯乙醇味；在硅質膜中央加入100 μl Solution E，置于室溫5 min后，12000 rpm離心2 min；離心得到的溶液再次加入離心柱中，室溫放置2 min，12000 rpm離心2 min，所得到的溶液問純化后的DNA，置于-20 ℃保存備用。

1.2.3 DNA濃度和純度的測定 采用美國Gene公司生產的微量核酸測定儀Nonodrop Lite檢測DNA濃度和純度，濃度低于10 ng/μl或A260/A280比值過大或過小的樣本將被棄用。

1.2.4基因分型 采用英國LGC公司生產的基于競爭性等位基因特異性PCR（KASP）技術的SNPline基因分型平臺對選定的MBL基因SNP位點rs7096206進行分型，獲得該位點的基因型頻率和等位基因頻率。引物序列為F：5'-ACGTTGGATGACGGTCCCATTTGTTCTCAC-3'，R：5'-ACGTTGGATGTTCATCTGTGCCTAGACACC-3'。

1.3統計學分析 運用EXECL 2003錄入數據，SPSS 13.0進行數據處理和分析，組間各位點基因型頻率和等位基因頻率差異比較采用？字2 檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義，采用非條件Logistic回歸模型進行多因素分析，計算比值比（OR）及95%置信區間（CI）。

2結果

2.1一般資料 共收集結核患者193例，其中男性99例，女性94例，年齡19～87歲，平均年齡（59.83±14.86）歲；共收集同時期健康體檢人員（對照組）142例，其中男性78例，女性64例，年齡19～79歲，平均年齡（52.63±18.81）歲；兩組間在性別和年齡上差異均無統計學意義（P>0.05）。

2.2 MBL基因rs7096206位點基因型在結核患者組和對照組中的分布 結核患者組中MBL基因rs7096206位點的野生型CC、雜合型GC、突變型GG三種基因型占比分別為61.66%（119/193）、36.79%（71/193）、1.55%（3/193），在142例對照組中三種基因型占比分別為72.53%（103/142）、26.76%（38/142）、0.70%（1/142），可見突變型堿基G在結核患者組的比例要高于對照組，但經過？字2檢驗，MBL基因rs7096206位點的三種基因型在結核患者組與對照組之間的分布差異并沒有統計學意義（？字2 =4.484，P=0.106>0.05）。

2.3 MBL基因rs7096206位點等位基因C和G在結核患者組和對照組中的分布 結核患者組等位基因C和G的頻率分別為80.05%（309/386）、19.95%（77/386），對照組等位基因C和G的頻率分別為85.91（244/284）、14.08%（40/284），經過？字2 檢驗，等位基因在兩組間的分布差異有統計學意義（？字2 =3.903，P=0.048<0.05），突變型堿基G在結核患者組中的分布顯著高于對照組，可見，攜帶G堿基比攜帶C堿基具有更高的結核病發病風險。

2.4 環境與遺傳對結核病發病的多因素分析 為排除其他危險因素的影響，采用多因素非條件Logistic回歸模型，以結核患者組和對照組為因變量，以MBL基因rs7096206位點基因型為分類自變量，在調整了性別、年齡、吸煙、飲酒等因素后，分析MBL基因rs7096206位點與結核病易感性的關系，結果顯示純合突變GG基因型和雜合突變CG基因型在結核病患者組中的分布顯著高于對照組，攜帶純合突變GG基因型的個體患結核病的風險是攜帶野生CC基因型的2.56倍（P<0.05，OR=2.56，95%CI：1.67-3.91），攜帶雜合突變CG基因型的個體患結核病的風險是攜帶野生CC基因型的1.27倍（P<0.05，OR=1.27，95%CI：0.82～1.95）。

3討論

結核病的發生發展是由遺傳因素和環境因素共同決定的，宿主易感基因在結核病發病機制中的作用越來越受到重視，眾多與結核病易感性有關的基因浮現于學者們的視野中，MBL是鈣離子依賴型凝集素成員之一，是機體免疫的一個重要組成部分，它能夠特異性識別和結合多種病原體表面糖蛋白鏈末端的甘露糖殘基，從而激活補體系統的免疫防御和免疫監視的作用[4]。

目前，關于MBL基因多態性與結核病易感性的關系，國內外已經有了多項研究，但尚未形成共識。美國一項研究認為MBL基因在美國的部分非洲裔人群和印度人群中等位基因的突變率明顯高于對照組，MBL基因突變增加結核病的感染風險，但在白種人和西班牙裔人群中的研究數據卻沒有顯示出MBL基因多態性與結核病有關[5]；國內劉洋等人采用限制性片段長度多態性技術對112例結核患者和120例健康對照者的MBL基因進行分型，發現結核病患者雜合子突變率高于對照組，因此認為MBL基因多態性可能與肺結核易感性有關，并與肺結核的復發相關[6]；Chen M等人通過對205例肺結核患者和216例對照者的病例對照研究發現，MBL基因rs7096206位點多態性與結核病易感性有關[7]。

本研究結果顯示，MBL基因rs7096206位點的三種基因型在新疆喀什地區結核患者組和對照組間的分布差異沒有統計學意義，但是等位基因在兩組間的分布差異有統計學意義，突變型等位基因G在結核患者組中的分布高于對照組，MBL基因rs7096206位點堿基G可能是結核病的危險因素，本研究結論與新疆塔城地區的開展的一項研究結論相似，李宇等人在新疆塔城地區收集了231例肺結核患者和226例就健康對照，對MBL基因進行了多態性分析，發現肺結核組GG基因型顯著高于健康對照組，認為MBL基因與新疆人群結核病相關，其可能是當地人群結核病的易感基因[8]。

研究基因多態性和疾病易感性關系時，由于受遺傳或環境等其它混雜危險因素的影響，加之樣本量又不足夠大，容易導致研究結果無法真實反映基因與疾病之間的關系，為此本研究將性別、年齡、吸煙、飲酒、飲茶、卡介苗接種史等因素作為協變量納入多因素Logistic回歸模型中進行分析，結果顯示攜帶GG或GC基因型的個體比攜帶CC基因型具有更高的結核病發病風險，這與一項博士畢業論文的研究結果較為相似，陳夢施等人在湖南省隨機抽取了4個縣級疾病預防控制中心登記的肺結核患者503例，將性別、年齡、婚姻、受教育程度、BMI等因素作為協變量進行多因素非條件Logistis回歸分析，認為MBL基因rs7096206位點的GC基因型在肺結核患者租的分布高于健康對照組（P<0.05），GC基因型個體患結核病風險是CC基因型的1.427倍（OR=1.427）[9]。

關于MBL基因與結核病易感性的關聯已經有了很多研究，但針對不同種族不同人群的研究并沒有得到相對統一的結論，且MBL基因在結核病發生發展中的作用機制也尚不明確，有待于進一步研究和探索。

參考文獻：

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[5]楊春娥，馮喜英，久太.結核病易感基因的研究現狀[J].中華肺部疾病雜志，2016，9（2）：207-209.

[6]劉洋，郭艷玲，孫琦，等.甘露醇結合凝集素基因多態性與肺結核易感性關系的研究[J].中國肺科雜志，2015，20（6）：971-974.

[7]Chen M，Deng J，Su C，et al.Impact of passive smoking，cooking with solid fuel exposure，and MBL MASP-2 gene polymorphism up-on susceptibility to tuberculosis[J].Int J Infect Dis，2014（29）：1-6.

[8]李宇，吳芳，章樂，等.MBL基因多態性與新疆漢族人群結核病易感性的研究[J].中國人獸共患病學報，2011，27（9）：769-773.

[9]陳夢施.湖南省漢族人群MBL與MASP2基因多態性與相關因素對結核易感性的綜合影響研究[D].中南大學，2014：1-112.

收稿日期：2018-5-25；修回日期：2018-5-30

編輯/李樺