二甲雙胍對大鼠腎缺血再灌注損傷后纖維化的影響

蘇娟

[摘要] 目的 探討二甲雙胍對大鼠腎臟缺血再灌注后纖維化改變的保護作用。 方法 采用隨機數字表法將24只SD雄性成年大鼠分為假手術（Sham）組、缺血再灌注（I/R）組和二甲雙胍（Metformin）處理組，每組8只。再灌注12周后，檢測各組大鼠血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）水平，蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色觀察腎組織結構變化和纖維化改變；免疫組織化學觀察α-平滑肌肌動蛋（α-SMA）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）分布；Western blot進一步檢測α-SMA和TGF-β1的表達水平。 結果 Sham組、I/R組和Metformin組間Cr和BUN比較差異無統計學意義（P > 0.05）。與Sham組比較，I/R組和Metformin組大鼠腎臟出現了明顯間質纖維化，但是Metformin組與I/R組比較腎臟間質纖維化明顯減輕；與Sham組比較，I/R組和Metformin組大鼠腎臟α-SMA和TGF-β1的表達水平顯著升高，Metformin組與I/R組比較，大鼠腎臟α-SMA和TGF-β1的表達水平顯著降低；差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 腎臟缺血再灌注損傷可以引起小管間質纖維化，二甲雙胍處理可以減輕此病理改變，其作用可能與二甲雙胍能夠抑制α-SMA和TGF-β1表達相關。

[關鍵詞] 缺血再灌注損傷；二甲雙胍；腎；纖維化

[中圖分類號] R692.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（a）-0022-05

[Abstract] Objective To assess the potential effects of Metformin on the development of tubulointerstitial fibrosis after acute renal ischemia-reperfusion. Methods Twenty-four male Sprague Dawley rats were randomly assigned to three groups： Sham group， I/R group and Metformin group （n = 8）. Twelve weeks after reperfusion， levels of serum urea nitrogen （BUN） and creatinine （Cr） were assessed； Hematoxylin-eosin （H&E;） and Masson′s trichrome staining were used to assess renal fibrosis； the expression spot and protein levels of α-smooth muscle actin （α-SMA） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） were analyzed by immunohistochemistry （IHC） and Western blot. Results There was no statistically significant difference in levels of Cr and BUN among Sham group， I/R group and Metformin group （P > 0.05）. Compared with the Sham group， tubulointerstitial fibrosis was more obvious in the I/R group and the Metformin group； however， the level of tubulointerstitial fibrosis in the Metformin group was less than that of the I/R group. Compared with the Sham group， the levels of α-SMA and TGF-β1 were significantly increased in the I/R group and the Metformin group， the expression of α-SMA and TGF-β1 in the Metformin group were significantly decreased compared with those in the I/R group； the differences were statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Administration of metformin significantly attenuated tubuleinterstitial fibrosis following I/R in rats， potentially via down-regulating expressions of α-SMA and TGF-β1.

[Key words] Ischemia-reperfusion injury； Metformin； Renal； Fibrosis

缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/R）在腎移植、腎部分切除手術、腎動脈狹窄、主動脈搭橋手術、栓塞性疾病、意外或醫源性損傷等過程中不可避免，是臨床診療過程中常見的一種病理生理改變[1-2]。腎缺血可導致急性再灌注損傷，從而導致腎功能延遲恢復，并可能導致腎臟纖維化改變，進而產生慢性腎功能損害[3-4]。二甲雙胍（Metformin）是一種常用的口服降糖藥，用于治療2型糖尿病。單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可以通過抑制合成代謝，促進分解代謝，增加ATP的合成，并降低ATP的利用，從而滿足缺血組織的能量需求，參與脂肪酸氧化、葡萄糖轉運、糖酵解、三酰甘油合成和蛋白質合成等一系列生物過程[5-9]。二甲雙胍能夠激活AMPK[10]，并已經被證實能緩解心臟缺血后的炎性反應，保護心臟功能[11]；AMPK激動劑被證實在體外和SD大鼠、犬體內均能減輕腎上皮細胞的缺血再灌注損傷[12-13]；此外，AMPK活化還能夠抑制心臟纖維化和肝纖維化過程[14-15]。但是，目前鮮有相關文獻報道二甲雙胍對缺血再灌注損傷造成的腎臟慢性纖維化是否具有保護作用。本研究采用SD大鼠構建腎缺血再灌注損傷慢性纖維化模型，探討二甲雙胍對腎缺血再灌注損傷導致的慢性纖維化是否具有保護作用，并探索其中可能涉及的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

24只健康成年雄性SD大鼠（SPF級），月齡6～8周，體重200～250 g，平均（235.3±6.5）g，均由武漢大學醫學院實驗動物中心提供（動物質量合格證號：4200980000106）。通過隨機數字表法將大鼠隨機分為3組：假手術組（Sham組）、對照組（I/R組）和二甲雙胍處理組（Metformin組），每組各8只。

1.2 儀器與試藥

α-平滑肌肌動蛋（α-SMA，19245）購自Cell Signaling Technology公司、轉化生長因子-β1（TGF-β1，sc-130148）和β-肌動蛋白（β-actin，sc-47778）單克隆抗體均購自Santa Cruz公司。血清Cr和BUN檢測采用全自動生化分析儀（Olympus，型號Au2700）。

1.3 動物模型的建立

大鼠在動物房，配置好飼料、飲水、墊料，做好通風，12 h/12 h明暗交替適應性喂養2周后，術前禁食12 h，禁水8 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（4390-14-3，購自Sigma）30 mg/kg麻醉。Sham組：麻醉成功后，經腹正中切口進入腹腔，先切除右腎，游離左側腎臟及腎蒂，但不夾閉腎蒂，手術后縫合關閉腹壁。I/R組：手術過程與Sham組相同，在切除右腎之后充分暴露并游離左腎及腎蒂，并將左腎蒂夾閉45 min然后開通恢復灌流，構建缺血再灌注模型。觀察腎臟由暗紅色變為紅色則表示復灌成功。Metformin組：手術過程同I/R組，從術后第1天開始連續經腹腔注射二甲雙胍125 μg/（kg·d），連續給予12周。

1.4 標本采集和處理

分別于缺血再灌注模型建立12周后，處死并收集靜脈血和腎臟組織標本。麻醉后，經下腔靜脈采血，然后處死各組大鼠，收集腎臟組織，一部分迅速置入液氮罐中保存待行蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測；另一部分用4%多聚緩沖甲醛溶液固定后，常規石蠟包埋，待行HE染色和免疫組化分析。

1.4.1 大鼠腎功能測定 采用全自動生化分析儀（Olympus，型號Au2700）測定每組大鼠血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平。

1.4.2 組織病理形態學 取大鼠腎組織，先用多聚甲醛固定，然后脫水、透明、浸蠟、包埋，再切片、脫蠟，行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后在400倍光鏡下觀察其病理改變并拍照；石蠟切片脫蠟蒸餾水洗后，蘇木精染液染核5 min，麗春紅酸性復紅液染5 min，2%冰醋酸水洗后，1%磷鉬酸分化3 min。用苯胺藍染5 min后，將切片依次放入95%乙醇、無水乙醇、二甲苯中，最后中性樹膠封固。在400倍光鏡下觀察染色情況。腎小管間質纖維化程度的評估，以皮質和外髓質部受損面積占每高倍鏡（400×）面積的百分比來判斷。

1.4.3 腎臟免疫組織化學 腎組織切片以新鮮配制的體積分數為3%的H2O2滅活細胞內源性過氧化物酶，然后用血清封閉，根據測試指標分別滴加α-SMA和TGF-β1抗體以及相應生物素化二抗，DAB顯色，封片。

1.4.4 Western blot檢測 取各組小鼠腎用RIPA組織細胞裂解液勻漿后裂解，提取細胞總蛋白SDS-PAGE進行蛋白質分離，電轉至NC膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，TBS洗膜。封閉液中按1∶1000加一抗即兔抗鼠α-SMA和TGF-β1單克隆抗體（β-actin作為內參），緩慢搖動4℃過夜，棄去一抗，TBST洗膜，加羊抗兔IgG二抗，緩慢搖動1 h，TBST洗膜。化學發光法曝光（ECL顯示法），顯影、定影后，拍照觀察膠片上的條帶，Imag J軟件分析灰度。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎功能變化

三組大鼠血清Cr和BUN水平的比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 組織學改變

光鏡下可見Sham組中的腎臟結構未見明顯改變，而I/R組中的腎臟明顯破壞，近曲小管的上皮細胞明顯壞死，可見大量炎癥細胞浸潤，可見管型。而Metformin組的腎臟組織損傷與缺血再灌注組比較相對較輕，近曲小管近端壞死明顯減少，偶見管型。見圖2（封四）。

Masson染色顯示，與Sham組比較，I/R組和Metformin組大鼠腎臟纖維化病變明顯；而與I/R組比較，Metformin組可以減輕因缺血導致的纖維化改變。各組纖維化程度比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖3（封四）、表1。

2.3 免疫組織化學表現

α-SMA主要表達于腎小管間質區，而TGF-β1主要表達于腎小管上皮細胞內，二者的陽性表達區域與腎小管間質纖維化病變區分布一致。I/R組和Metformin組大鼠腎臟α-SMA和TGF-β1水平均明顯高于sham組（P < 0.01）；而與I/R組比較，Metformin組的上述指標水平顯著下降（P < 0.01）。見圖4（封四）、表2。

2.4 Western blot檢測

Western blot檢測結果顯示，I/R組、Metformin組與Sham組比較，α-SMA的表達明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05）；Metformin組與I/R組比較，α-SMA的表達明顯減少，差異有統計學意義（P < 0.05）。TGF-β1在I/R組、Metformin組的表達明顯高于Sham組，差異有統計學意義（P < 0.05）；TGF-β1在Metformin組的表達又低于I/R組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖5。

3 討論

I/R是在缺血的基礎上恢復血流后，組織器官的損傷反而加重的現象。腎小管內皮及上皮細胞自身具有一定的修復功能，輕度的急性I/R所導致的腎臟功能及病理損傷是可逆的。但是，隨著腎缺血缺氧時間的延長，近期會導致腎的微觀結構發生明顯改變，引起急性腎功能不全；遠期主要表現為腎小管內各種膠原纖維表達增多，導致明顯地間質纖維化改變，間質纖維化嚴重時會導致腎單位減少、腎功能不全，最終可能發展為慢性腎功能衰竭。

有文獻報道，因I/R導致的腎功能衰竭的患者都會有不同程度的腎臟結構的改變和功能的損害[16]。在本研究中，術后12周時Sham組、I/R組和Metformin組Cr及BUN水平差異無統計學意義，但在病理形態學上I/R組和Metformin組腎小管仍可見明顯損傷后改變。本研究中，HE染色顯示Sham組中的腎臟結構未見明顯改變，而I/R組中的腎臟結構明顯破壞，但在Metformin組中損傷明顯減輕；Masson染色顯示，在I/R 12周后腎臟出現了明顯的腎小管間質纖維化改變；但是，在Metformin組中腎纖維化程度明顯減輕。

二甲雙胍是一種常用的口服降糖藥，近來多項研究證實，它還具有抗炎、抗腫瘤和抗纖維化的作用[17-20]。α-SMA是肌成纖維細胞的重要標志之一，也是細胞外基質的重要來源。一般情況下，α-SMA僅僅在未缺血缺氧腎臟組織的血管中表達，但是在各種缺血缺氧損傷后，α-SMA在整個器官組織中都可以見到表達明顯增加。TGF-β1是導致纖維化改變的重要因子[21]，是公認的促纖維化因子，其通過與受體結合活化下游基因，其增加產生一系列導致肌成纖維細胞增多的靶蛋白，引起間質纖維化。本研究免疫組化和Western blot結果均顯示，I/R組和Metformin組大鼠腎臟α-SMA和TGF-β1的表達水平均顯著高于Sham組；而與I/R組比較，Metformin組的α-SMA和TGF-β1水平顯著下降。

綜上所述，長時間腎臟I/R會導致腎小管嚴重損傷，而且這種損傷是不可逆的，遠期會引起腎小管間質纖維化改變，導致慢性腎功能不全，二甲雙胍可能通過減少促纖維因子α-SMA和TGF-β1的表達，從而減輕腎小管形態學改變、促進腎臟功能的恢復，進而抑制腎小管間質纖維化改變。二甲雙胍作為一種最常用的降糖藥物，經濟實用、服用方便、副作用少，很有潛力成為一種減少腎缺血再灌注損傷的治療藥物。

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