SIRT1活化對TGF-β1誘導的足細胞ILK PCNA的影響

時延朋 楊汝春? 張華琴 萬鳳

腎小球足細胞是一種高度分化的上皮細胞，與毛細血管內皮細胞、基底膜共同構成腎小球濾過屏障，在外界各種損傷因素刺激下，足細胞的結構和功能發生改變，腎小球濾過屏障遭受破壞，從而引發蛋白尿［1-2］，若不及時治療則會導致腎小球硬化，最終導致腎臟衰竭。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-beta，TGF-β1）是一種誘導足細胞轉分化的細胞因子，也是引起腎臟纖維化、腎小球硬化的主要誘導因子之一［3］。整合素連接激酶（ILK）與增殖細胞核蛋白（PCNA）在正常腎組織中表達水平均較低，而在腎小球足細胞表型發生轉分化時則表達上調。2016年6月至2017年12月作者通過實驗研究探討，沉默信息調控因子1（Silent information regulator 1，SIRT1）對腎小球足細胞表型的影響機制。

1 材料與方法

1.1 主 要 試 劑 RPMI1640（GIBCO）， 胎 牛 血 清（GIBCO），重組鼠干擾素γ（Recombinant Murine interferon-γ，γ-IFN，美國Peprotech Inc，315-05），Recombinant Human TGF-β1（ 美 國 Peprotech Inc，100-21），SRT1720（Selleck，016025），兔抗 α-SMA（EPIC MICS，YH090708D），ILK（Santa-Cruz，sc-20019），PCNA（Santa-Cruz，sc-56），鼠抗 GAPDH（達文生物，DW880543），IR Dye 800CW Goat Anti-Rabbit（C60107-06）；IR Dye 680LT Goat Anti-mouse（C51007-05），CCK-8（Dojindo，CK04）。

1.2 方法 （1）細胞培養及分化：永生化溫度敏感小鼠足細胞株由Mundel教授惠贈，浙江省兒童醫院毛建華教授轉贈。將復蘇的足細胞用含有γ-干擾素（γ-IFN）100U/ml和10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養，置33℃、5%CO2培養箱中孵育，讓細胞增殖傳代。誘導分化時，將培養液換成不含γ-IFN的培養基培養，并轉移至37℃、5%CO2培養箱中培養2周。（2）細胞分組：將分化成熟的足細胞分為正常組、模型組、白藜蘆醇組（5μM）和SRT1720-2μM、SRT1720-1μM組。細胞干預前換含2%胎牛血清的RPMI1640培養液，模型組用2ng/ml的TGF-β1刺激72h，白藜蘆醇組和SRT1720-2μM組、SRT1720-1μM組分別先加白藜蘆醇至5μM、SRT1720至2μM和1μM干預30min，然后用2ng/mlTGF-β1刺激72h。（3）Western-blot技術檢測蛋白表達豐度：去除細胞培養液，用預冷的PBS洗2次，加入RIPA細胞裂解液，收集樣本，低溫離心，取上清液，用BCA法測蛋白濃度。取蛋白進行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離蛋白，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗，4℃過夜；去一抗，PBST緩沖液洗3次，再加入相應的熒光二抗，室溫孵育1.5h；PBST緩沖液洗6次，通過Odyssey CLx近紅外雙色熒光成像系統顯影并分析結果。（4）CCK-8法檢測細胞存活率：將足細胞以2000個/孔接種于96孔板，按照實驗分組給予不同藥物作用，培養72h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，將培養板置于37℃、5%CO2培養箱中培養2h，用酶標儀在450nm處測定OD值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料用（±s）表示，多組間采用one-way ANOVA檢驗，組間兩兩比較用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1對足細胞存活率的影響 TGF-β1各劑量組與正常組比較，差異無統計學意義。見表1。

表1 TGF-β1對足細胞存活率的影響（±s）

表1 TGF-β1對足細胞存活率的影響（±s）

組別 n 存活率（%）正常組 5 100.0±2.7 TGF-β1（2ng/ml）組 5 104.2±10.0 TGF-β1（5ng/ml）組 5 98.3±8.0 TGF-β1（10ng/ml）組 5 94.3±6.3

2.2 白藜蘆醇和SRT1720對足細胞存活率的影響 白藜蘆醇組和SRT1720各劑量組與正常組比較，差異無統計學意義。見表2。

表2 白藜蘆醇和SRT1720對足細胞存活率的影響

2.3 白藜蘆醇和SRT1720對TGF-β1刺激的足細胞存活率的影響 除正常組外，其余各組用TGF-β1刺激，經白藜蘆醇和SRT1720干預后足細胞存活率降低，且與TGF-β1組比較差異有統計學意義（P＜0.05），SRT1720-2μM和SRT1720-1μM組降低更加明顯。見表3。

2.4 白藜蘆醇和SRT1720對TGF-β1刺激的足細胞PCNA的影響 足細胞經TGF-β1刺激后PCNA蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），而白藜蘆醇和SRT1720干預則能夠逆轉上述變化，使足細胞PCNA蛋白表達量降低（P＜0.05）。見表4、圖 1。

表4 白藜蘆醇和SRT1720對TGF-β1刺激的足細胞PCNA的影響

圖1 各組PCNA/GAPDH比較

2.5 白藜蘆醇和SRT1720對TGF-β1刺激的足細胞ILK的影響 與正常組比較，TGF-β1組足細胞ILK蛋白表達明顯上調（P＜0.05）；經白藜蘆醇和SRT1720干預后足細胞ILK蛋白表達下降（P＜0.05）。見表5、圖2。

表5 白藜蘆醇和SRT1720對TGF-β1刺激的足細胞ILK的影響

圖2 各組ILK/GAPDH比較

2.6 白藜蘆醇和SRT1720對TGF-β1刺激的足細胞α-SMA的影響 正常足細胞在TGF-β1刺激后α-SMA蛋白表達量升高（P＜0.05），白藜蘆醇和SRT1720干預后α-SMA蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。見表 6、圖 3。

表6 白藜蘆醇和SRT1720對TGF-β1刺激的足細胞α-SMA的影響

圖3 各組α-SMA/GAPDH比較

3 討論

腎小球足細胞位于腎小球基底膜的外側，由胞體、主突、足突組成，是構成腎小球濾過屏障的重要組成部分。TGF-β1是一種多功能的細胞調節因子，能夠誘導腎小球足細胞發生上皮細胞向間充質細胞轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），導致細胞表型發生改變［2，4］，腎小球濾過屏障遭到破壞。本實驗結果顯示當足細胞經TGF-β1誘導后，存活率有所增加，可能與足細胞轉分化以后，細胞表型改變，產生新的亞型，導致其異常增殖有關。經白藜蘆醇和SRT1720干預后，足細胞存活率下降，推測因SIRT1被激活，從而抑制TGF-β1誘導的足細胞轉分化，細胞異常增殖情況得到改善。

ILK是一種新發現的粘附蛋白，具有多種生物學活性，為間充質細胞標志蛋白，與足細胞表型改變密切相關，在調節細胞周期、基質積聚、腫瘤發生［5-6］、維持腎小球基底膜的完整性、保持腎小球的濾過功能和防止蛋白質的漏出中起重要作用［7］。PCNA又稱周期蛋白（cyclin），是一種僅在增殖狀態細胞核內出現的非組蛋白型核蛋白質［8］，其在成年大、小鼠腎小管、集合管和腎小球中有少量細胞表達［9-10］。研究表明PCNA在增殖細胞中的含量變化有明顯的周期性，可反映細胞增殖活性、判斷細胞增殖狀況，是細胞增殖程度的可靠指標［11］。本資料顯示，當足細胞經TGF-β1誘導后，ILK和PCNA蛋白的表達顯著升高，且間充質細胞標志蛋白α-SMA的表達也上調，提示TGF-β1成功誘導腎小球足細胞轉分化，足細胞已失去原有的形態結構和功能，細胞異常增殖活性升高。

白藜蘆醇和SRT1720是公認的SIRT1激活劑，且SRT1720的激動效果比白藜蘆醇強1000倍［12］。研究顯示，白藜蘆醇和SRT1720能夠減少蛋白尿和足細胞損傷，具有明顯的腎臟保護作用［13-14］。本資料中，白藜蘆醇和不同劑量的SRT1720對TGF-β1誘導的腎小球足細胞干預后，ILK和PCNA蛋白表達顯著降低，且對SRT1720具有劑量依賴性，同時白藜蘆醇和SRT1720還可降低間充質細胞標志蛋白α-SMA的表達，這表明SIRT1激活劑能夠顯著抑制TGF-β1誘導的腎小球足細胞轉分化，降低細胞的異常增殖，對腎小球足細胞具有明顯的保護作用。且5μM白藜蘆醇和1-2μM SRT1720對足細胞的存活率無顯著影響，提示其對正常足細胞無顯著毒副作用。

綜上所述，白藜蘆醇和SRT1720激活SIRT1對TGF-β1誘導的腎小球足細胞轉分化具有顯著抑制作用，SIRT1活化可能是糾正足細胞病理形態改變、維持足細胞正常表型、防治蛋白尿發生的重要分子靶點。