基因轉染建立高表達轉化生長因子β1大鼠肝星狀細胞的實驗研究

周霞 黃效模 張一 曾德珍?

肝纖維化的形成機制是一個有眾多因素參與復雜的病理過程，肝纖維化實質是慢性肝病損傷修復反應，肝星狀細胞（HSC）在肝纖維化過程中起核心作用，各種原因肝損傷時，引起肝臟細胞外基質（ECM）合成增加，降解減少，進而造成肝內ECM不斷積聚，最后導致肝纖維化甚至肝硬化。TGFβ1是HSC活化最重要的因子之一［1］，目前大多數抗纖維化研究均以HSC為靶標，2017年3月至12月作者通過實驗研究，擬建立高表達TGFβ1的HSC陽性克隆，為肝纖維化的防治提供細胞實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6由武漢協和醫院胃腸病實驗室提供。pcDNA3.1（+）質粒、感受態大腸桿菌DH-5ɑ購自武漢晶賽生物工程技術公司，限制性核酸內切酶 NheI、XbaI、SmaI、Bg1II、EcoRI、T4多聚核苷酸激酶和Taq酶購自TAKARA公司，T4 DNA連接酶購自New England Biolabs，凝膠回收試劑盒和小量質粒提取試劑盒購自寧波中鼎公司，寡核苷酸DNA單鏈由上海博亞生物技術有限公司合成。陽離子脂質體Lipofectamine 2000 購自Invitrogen 公司，TRIzolTM Reagent 購自Invitrogen公司，新生SD大鼠由同濟醫科大學實驗中心提供。

1.2 方法 （1）質粒構建：根據已知的大鼠TGFβ1基因序列合成目的片段引物：TGFβ1引物： P1：5'-GGAATTCGCCACCATGGGCATGCCGCCCTCGGGG CT-3'，P2：5'-CCGCTCGAGTCAGCTGCACTTGCAGGA GCG-3'。TGF 1兩端有EcoRI和XhoI酶切位點。以大鼠cDNA為模板擴增TGFβ1基因中1.2kb的目的基因片段，PCR反應條件為：94℃變性5min進入循環過程，94℃變性20s，60℃下退火25s，72℃延伸75s，循環32次后72℃復性3min，凝膠電泳回收TGFβ1產物，限制性內切酶EcoRI和XhoI酶切TGFβ1產物回收1.2kb的酶切產物。（2）表達載體構建：TGFβ1酶切產物通過T4連接酶與EcoRI和XhoI酶切的質粒pcDNA3.1（+）連接，轉化感受態DH-5ɑ，新霉素抗性篩選重組子pcDNA3.1（+）-TGFβ1，酶切鑒定成功后，菌液由上海英俊公司進行測序分析。同時，用含綠色熒光蛋白的pcDNA3.1（+）-EGFP為陰性對照質粒。（3）pcDNA3.1（+）-TGFβ1轉染HSC及G418的篩選：大鼠肝星狀細胞株HSC-T6含15%胎牛血清（FCS）的DMEM液，置于37℃，體積分數為5%CO2孵育箱中培養。轉染前1d，將HSC-T6細胞接種于6孔培養板，每孔2×105個細胞，過夜培養后，將構建的質粒轉染細胞，操作按脂質體Lipofectamine 2000 轉染手冊進行。取一試管加入質粒2μg，用250μl Opti-MEM 培養基混合稀釋，另一試管加入脂質體Lipofectamine 2000 5μl，用250μl Opti-MEM培養基混合稀釋。室溫無菌條件下放置5min，兩試管混合后放置20min，在6孔板中每孔加入量為500μl混合液培養4h，更換培養液繼續培養，48h后計算轉染率，并改用含400μg/mlG418培養基，15%FCS的DMEM培養液2ml，6d后細胞大部分凋死，G418濃度減至200μg/ml維持篩選，殘存細胞約16d后形成陽性克隆，更換為正常培養液繼續培養和傳代。并將細胞分為pcDNA3.1（+）-TGFβ1轉染組，pcDNA3.1（+）-EGFP轉染組，未傳代及轉染細胞為空白組，正常培養傳代21d的空白組細胞為陰性對照組。（4）熒光定量PCR檢測TGFβ1mRNA的表達：篩選陽性克隆后，繼續培養48h，用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，熒光定量PCR法分別擴增TGFβ1mRNA。按定量RT-PCR試劑盒說明取1μg總RNA逆轉錄合成cDNA，然后以Sybr Green I作為熒光標記物，在LightCycler熒光實時定量PCR儀（Roche公司，德國）上進行PCR反應。PCR引物：TGFβ1：5'-GAGGCGGTGCTCGCTTTGTA-3'，下游引物 5'-TTGTTGCGGTCCACCATTAGC-3'。反應條件如下：預變性94℃ 3min，50個循環中94℃ 30s，53℃30s，72℃ 30s，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，CT法進行相對定量。（5）Western blot法測定TGF-β1的表達：收集各組細胞，消化后加入預冷的細胞裂解液，置冰上30min，4℃、12000g離心，取上清液進行蛋白分光光度儀定量（考馬斯亮蘭法），每組取20μg蛋白加熱變性后，10%SDS-PAGE電泳分離，電轉移至PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的Tris鹽溶液封閉2h，加入1：200稀釋的一抗兔抗TGFβ1多克隆抗體，4℃孵育過夜。用含吐溫-20的Tris鹽溶液洗膜3次，加入1：5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫下孵育1h。化學發光法（ECL）檢測條帶。β-actin作為內參。上述實驗均重復3次，并計算機掃描電泳圖像。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料用（±s）表示，用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒的鑒定 重組質粒pcDNA3.1（+）-TGFβ1用BamHI酶切，經2%瓊脂糖凝膠電泳后可見1.2kb的清晰條帶，進行測序結果與GenBank所提供的序列完全相同，提示含有TGFβ1基因的pcDNA3.1（+）構建成功。見圖1。

圖1 重組pcDNA3.1（+）-TGFβ1BamHI單酶切鑒定結果

2.2 脂質體對Lipofectamine 2000對細胞毒性作用的G418篩選 應用轉染試劑Lipofectamine 200 pcDNA3.1（+）-TGFβ10轉染HSC-T6細胞后鏡下觀察顯示，在5μl的用量下HSC-T6細胞轉染前、后的形態和數目與對照組及空白組無明顯差異，瞬時轉染48h后測得轉染率為28.2%。篩選結果顯示，G418篩選試劑的最佳濃度為400μg/ml，應用21d后可篩選出穩定表達的細胞克隆，并能進一步培養傳代。見圖2。

圖2 轉染48h EGFP的表達

2.3 TGFβ1mRNA的表達情況 熒光定量PCR法檢測TGFβ1的mRNA表達，結果顯示：pcDNA3.1（+）-TGFβ1轉 染 組 TGFβ1的 mRNA 表 達 較 pcDNA3.1（+）-EGFP質粒轉染組、空白組及對照組明顯增高［（20.220±0.879）vs（9.609±1.607）vs（5.122±3.512）vs（6.213±0.259），P＜0.05］。

圖3 Wester blot 法檢測各組TGFβ1蛋白的表達

2.4 TGFβ1蛋白的表達情況 Western blot印跡法檢測TGFβ1蛋白表達。TGFβ1在SDS-PAGE凝膠電泳中表現為46KD的條帶，實驗顯示：pcDNA3.1（+）-TGFβ1轉染組TGFβ1蛋白的表達較pcDNA3.1（+）-EGFP質粒轉染組、空白組及對照組明顯增高［（0.968±0.822）vs（0.319±0.083）vs（0.211±0.024）vs（0.250±0.086），P＜0.05］。見圖 3。

3 討論

肝纖維化指肝臟纖維結締組織的過度沉積，是ECM合成和降解不平衡的結果，是各種慢性肝病向肝硬化發展所共有的病理改變和必經途徑。早期肝纖維化經治療可以逆轉［2］，因此深入開展肝纖維化形成機制的研究有十分重要的意義。目前認為HSC的激活是肝纖維化形成機制的中心環節。慢性肝損害過程中，大量細胞因子通過介導細胞-細胞間，基質-細胞間相互作用影響HSC，激活并促使HSC大量合成ECM，導致ECM過分沉積出現肝纖維化。在HSC的激活、致纖維化以及與其他細胞的相互作用的過程中，多種因素參與該過程的調節，細胞因子起重要作用，而TGF-β1是激活 HSC 的最重要促進因子［3］。

TGFβ是一種多功能的多肽類細胞因子，幾乎體內所有細胞都能分泌TGFβ并存在其受體，在細胞的生長調節中起重要作用。自從1983年TGFβ1及隨后其他兩個成員TGFβ2、TGFβ3在哺乳類動物中發現，關于TGFβ的研究也越來越引起人們的重視。TGFβ家族是已知與纖維化形成關系最密切的細胞因子［4］，其中，TGFβ1是最重要的致纖維化因子［5］，在肝纖維化發展過程中起重要作用。TGFβ1是啟動鄰近靜息態HSC激活和轉化的初始信號之一，Gressner［6］等在肝纖維化形成的3步激活模式中表明TGFβ1的這種初始激活作用，并已被大量研究證實。Kupper細胞、單核細胞、血小板的旁分泌及HSC的自分泌是TGFβ1早期持續增高并使肝纖維化持續發展的重要原因。TGFβ1所介導的信號通道被認為在HSC的活化及ECM的產生起重要作用［7］。

HSC 作為肝纖維化發病的關鍵環節倍受關注，以HSC 為靶標的治療措施逐漸成為抗纖維化的重要方法［8］。因此，構建pcDNA3.1（+）-TGFβ1真核表達載體并轉染HSC，建立高表達TGFβ1的HSC，模擬肝纖維化過程中TGFβ1高表達的體內環境，并以此為細胞為基礎進行下一步研究。本資料表明，pcDNA3.1（+）-TGFβ1真核表達載體構建成功，并可成功轉染HSC，轉染率為28.2%，48h后加入G418篩選，約21d可形成陽性克隆，經熒光定量PCR及Western blot鑒定，克隆細胞高表達TGFβ1mRNA及蛋白，表明高表達TGFβ1的HSC篩選成功。鑒于HSC在肝纖維化發病機制中的主導作用，可應用高表達TGFβ1的HSC開展肝臟疾病，尤其是肝纖維化、肝硬化的研究，可得到更為可信且直接的實驗結果，為肝纖維化的防治提供理論依據。