去甲斑蝥素對人卵巢癌細胞株AO增殖及細胞周期的影響

熊禮鳳 楊江升 樓銀妹 汪霖 李平兒 李華美

斑蝥是祖國醫學寶庫中，被反復證明行之有效的抗腫瘤藥物［1］，后人依據其抗腫瘤的有效成分人工合成了抗癌新藥—去甲斑蝥素（NCTD），在保留斑蝥抗癌活性的同時，還具有升高白細胞及增強機體自身的免疫能力等諸多優點，臨床上用于消化道惡性腫瘤的治療方面已取得較好的臨床療效［2-5］。但其在卵巢癌應用基礎研究和臨床研究方面還相當薄弱［6］。作者自2015年11月至2018年1月通過實驗研究，探討NCTD對人卵巢癌細胞株AO增殖的抑制作用及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗細胞株及培養：選擇中國科學院上海細胞生物研究所培育的人卵巢癌細胞株AO（或3AO）。細胞在37.0℃，5%CO2條件下，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液培養，每間隔72h用0.25%胰蛋白酶消化，傳代1次/2～3d。（2）主要試劑及儀器：去甲斑蝥素（NCTD，北京第四制藥廠）；0.4%臺盼藍染液（Gibco）；RPMI-1640液體培養基及胰蛋白酶（GIBCO）；磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS，博士德）；胎牛血清（四季青）；流式細胞儀（Beckman-Coulter）。

1.2 方法 （1）人卵巢癌細胞株AO培養的制備：人卵巢癌細胞株AO培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，一般傳代1次/2～3d，實驗所用的細胞均處于對數生長期。（2）人卵巢癌細胞株AO的增殖檢測：取對數生長期的人卵巢癌細胞株AO共約5×105個分別接種于96孔板，分別加入終濃度為1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml， 以 0μg/ml（生理鹽水）為對照的NCTD分別作用24、48、72h，各設置3個復孔，以生理鹽水作為對照。按時間點收集人卵巢癌細胞株AO懸液；用100μl培養基重懸細胞，吸取10μl細胞懸液加入10μl臺盼藍染液中，輕輕混勻，染色1min，吸取少量已染細胞計數。3min計數完畢。細胞抑制率=（對照組存活細胞總數-實驗組存活細胞總數）/對照組存活細胞總數×100%。（3）流式細胞儀檢測：取對數生長期的人卵巢癌細胞株AO，按密度約1×106/ml接種于96孔板培養液中，并予終濃度1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml， 以 0μg/ml（ 生 理鹽水）為對照的NCTD處理48h。48h后予以離心收集全部細胞，PBS洗2遍，用70%的冰乙醇重懸細胞，-20℃固定過夜，用PBS洗滌1遍，棄上清液加300μl DNA染液（內含碘化丙啶100g/ml和RNA酶20U/ml）37℃避光染色30min，PBS再洗滌2遍，流式細胞儀上檢測，上述實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的NCTD對人卵巢癌細胞株AO的增殖影響 隨NCTD濃度及作用時間的遞增，其對人卵巢癌細胞的抑制效率也逐步增加，且各濃度組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度NCTD對人卵巢癌細胞株AO的增殖影響［%，（±s）］

表1 不同濃度NCTD對人卵巢癌細胞株AO的增殖影響［%，（±s）］

注：與0μg/ml比較，#P＜0.05；與1μg/ml比較，*P＜0.05；與5μg/ml比較，△P＜0.05；與10μg/ml比較，☆P＜0.05

濃度（μg/ml）9.01±1.51 18.01±1.65 31.12±2.74 1 20.45±3.25# 37.04±4.65# 54.42±6.41#5 40.82±4.54#* 57.22±6.74#* 75.08±5.49#*10 56.98±4.79#*△ 72.49±4.65#*△ 91.13±3.15#*△20 79.22±5.49#*△☆ 94.11±2.75#*△☆ 98.50±0.35#*△☆作用時間（h）24 48 72 0

2.2 不同濃度的NCTD對人卵巢癌細胞株AO細胞周期的影響 與對照組比較，人卵巢癌細胞株AO經不同濃度的NCTD作用48h后的G0/G1，G2/M與S期差異有統計學意義（P＜0.05）。G2/M期細胞百分數明顯增加，S期及G0/G1期細胞百分數減少，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著NCTD濃度的升高，G2/M期細胞百分數明顯增加，S期及G0/G1期細胞百分數減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同濃度NCTD處理48h細胞周期分布情況［%，（±s）］

表2 不同濃度NCTD處理48h細胞周期分布情況［%，（±s）］

注：與0μg/ml比較，#P＜0.05；與1μg/ml比較，*P＜0.05；與5μg/ml比較，△P＜0.05；與10μg/ml比較，☆P＜0.05

57.12±2.40 17.29±1.62 25.51±1.32 1 59.24±1.55# 15.36±0.75# 23.44±2.07#5 62.33±2.61#* 12.16±1.42#* 20.52±0.96#*10 65.20±3.05#*△ 9.61±0.63#*△ 18.46±2.12#*△20 72.14±2.12#*△☆ 7.45±0.36#*△☆ 12.65±1.26#*△☆濃度（μg/ml） G2/M S G0/G1 0

3 討論

卵巢癌是發生在女性生殖系統惡性腫瘤的三大腫瘤之一，具有起病隱匿、早期臨床癥狀不典型、易發生轉移、預后差等特點［7］。因此雖然卵巢癌的發病率低于宮頸癌和子宮內膜癌，位居第3位，但其病死率卻居女性生殖系統惡性腫瘤的首位［8］，＞70%的卵巢癌患者就診時已有盆腔或淋巴結轉移，已為中晚期，失去根治性手術的機會，5年生存率均不＞30%［9-10］，嚴重威脅患者的生命和健康。盡管目前臨床上化療是卵巢癌治療主要手段，但患者對化療藥物的耐藥性、不敏感性及部分患者對化療的不耐受性，是腫瘤科醫師面對的臨床問題。因此，為卵巢癌患者尋找高效、低毒的抗癌藥物是研究的重點和熱點。

本資料顯示，NCTD抑制人卵巢癌細胞增殖，在一定濃度下具有劑量及時間依賴性，NCTD在20μg/ml可短時間內在體外大量殺滅人卵巢癌細胞株AO。其抗癌機制是抑制惡性腫瘤細胞的蛋白質合成，降低腫瘤細胞CAMP的相關活性。進一步研究NCTD對人卵巢瘤細胞周期的影響。結果發現NCTD能使人卵巢瘤細胞發生周期阻滯，腫瘤細胞大多阻滯在G2/M期。提示NCTD誘導的人卵巢癌細胞株AO生長周期阻滯于DNA合成前期，并導致細胞分裂期細胞數量減少，細胞增殖受抑，從而達到NTCD抑制腫瘤細胞增殖的作用。

結果表明NCTD有望成為一種新型、有效、低毒的抗卵巢癌藥物，也可與各種化療方案聯用，不僅可增強殺瘤效應，還同時具有升高白細胞，增強自身免疫力等作用。