TGF-β2 TβRⅡ及Smad4在年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中的表達

蔡平福 李俊? 俞頌平

白內障形成的過程中，晶狀體上皮細胞發生了一系列退行性及增殖性改變。研究表明，不同類型的白內障所發生的機制不同。在此過程中，生長因子，尤其是轉化生長因子β2（TGF-β2）起重要作用。Smad4是腫瘤抑制基因DPC4產物，是不同TGF-β超家族成員信號傳遞必需的核心分子［1］。近年來，國外一些學者已經對TGF-β/ Smad4信號通路在年齡相關性白內障中的作用展開了研究［2-3］。作者應用免疫組化的方法檢測TGF-β2、TβRⅡ及Smad4在核性白內障及皮質性白內障晶狀體上皮細胞中的表達，探討其發病機制，擬為年齡相關性白內障預防與治療提供新的思路。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2016年12月本院收治年齡相關性白內障患者80例為觀察組，其中皮質性白內障32例（40眼），核型27例（40眼）。排除未熟期及過熟期白內障，并排除全身性疾病引起的白內障。所有對象均由同一位具有豐富超聲乳化手術經驗的醫師在手術顯微鏡下完成，術中取晶狀體前囊膜。所有標本用平衡鹽液洗去其表面粘彈劑，予以 4%多聚甲醛溶液中固定、脫水、透明、包埋并制成蠟塊，連續切片，厚度約3μm。本項目經本院倫理委員會批注，患者知情并簽署知情同意書。

1.2 方法 采用免疫組化二步法檢測 TGF-β2、TβRⅡ及 Smad4 的表達，鼠抗人TGF-β2單克隆抗體，兔抗人Smad4多克隆抗體，兔抗人TβRⅡ多克隆抗體，SABC試劑盒及即用型鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶免疫組化染色超敏試劑盒均購自于武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色劑購自于福州邁新生物技術有限公司，多聚賴氨酸處理過的載玻片購自于美國Sigma公司。

1.3 判斷標準 DAB顯色后，TGF-β2、TβRⅡ陽性細胞的著色部位在晶狀體上皮細胞的胞漿，呈棕黃色或棕褐色，胞核呈陰性。Smad4陽性細胞的著色部位在晶狀體上皮細胞的胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒或團塊，胞核呈陰性。采用 olympus成像系統及 Image-Pro Plus 圖像分析軟件作TGF-β2、TβRⅡ及Smad4蛋白表達的半定量分析。隨機觀察10個高倍鏡下視野，鏡下視野清晰，無壞死、出血，計算陽性百分率，以100個細胞中所含陽性細胞個數進行統計。

1.4 統計學分析 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組比較用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 SNK-q檢驗，采用 Spearman 檢驗進行相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織切片觀察 核性白內障組晶狀體上皮細胞密度明顯比皮質性白內障組高。見圖1。

圖1 晶狀體上皮組織切片

2.2 免疫組化檢測晶狀體上皮細胞TGF-β2、TβRⅡ和Smad4的表達 見表1。

表1 兩組白內障患者晶狀體上皮細胞中TGF-β2、TβRⅡ和Smad4陽性表達的比較［﹪，（±s）］

表1 兩組白內障患者晶狀體上皮細胞中TGF-β2、TβRⅡ和Smad4陽性表達的比較［﹪，（±s）］

TGF-β2 TβRⅡ Smad4皮質性白內障組 46.32±5.47 51.77±6.98 60.34±10.15核性白內障組 27.21±3.36 35.86±7.52 11.33±1.17 t值 18.8272 9.8072 30.3377 P值 0.0000 0.0000 0.0000

2.3 TGF-β2和smad4的相關性 經直線相關分析表明，TGF-β2與smad4的表達水平呈正相關性（r1=0.673，P1＜0.05 ；r2=0.689，P2＜0.05）。見圖 2、3。

圖2 皮質性白內障組Smad4與TGFβ2陽性表達散點圖

圖3 核性白內障組Smad4與TGFβ2陽性表達散點圖

3 討論

年齡相關性白內障包括皮質性、核性、囊下性3種，其中皮質性白內障與核性白內障在病程、疾病的發生、發展及臨床表現上有明顯的不同，并在組織學上有較大差異。提示這兩種類型的白內障在發病機制上存在不同。年齡相關性白內障發生的過程中最早發生的是晶狀體上皮的損害，即晶狀體囊下上皮細胞發生多種退行性及增殖性改變。而晶狀體本身為一無血液供應的器官，其增殖、分化和凋亡是由晶狀體上皮細胞分泌的細胞外基質和細胞因子調控的［4］。TGF-β是一種多功能的細胞分裂調節劑，其中TGF-β2主要存在于眼內，其它組織中幾乎不含TGF-β2。研究表明，人眼內TGF-β2通過抑制晶狀體上皮細胞增殖而導致晶狀體的混濁［5-6］。

DPC4基因位于人染色體18q21，具有2860bp轉錄單位，11個外顯子，其產物Smad4與其它Smads相互作用構成TGF-β信號傳導通路中必需的中心環節，亦在TGF-β的生長抑制作用中擔當重要角色［1］。

本資料顯示，晶狀體組織切片可以清楚觀察到核性白內障組晶狀體上皮細胞密度明顯比皮質性白內障組高。柳夏林［7-8］等通過探討晶狀體上皮細胞密度的改變與不同類型年齡相關性白內障的關系中發現核性白內障的晶狀體上皮密度高于同年齡組其它類型白內障及對照組透明晶狀體上皮細胞的密度。本資料顯示，在皮質性白內障中TGF-β2、TβRⅡ的陽性表達均比核性白內障組高，差異有統計學意義。以往研究表明，晶狀體上皮細胞中增殖細胞核抗原在核型白內障中的表達高于皮質性白內障。作者認為，核性白內障晶體上皮細胞中TGFβ2及TβRⅡ表達較低，對晶體上皮細胞增殖的抑制作用較弱，晶狀體上皮細胞增殖較為活躍。而皮質性白內障較高的TGFβ2及TβRⅡ誘導晶體上皮細胞發生凋亡，進而導致晶狀體水、電解質平衡及營養代謝的障礙，促使晶狀體發生混濁，白內障發生［9］。本資料結果表明皮質性白內障中Smad4的陽性表達比核性白內障組高，且Smad4與TGFβ2的表達水平呈正相關。進一步證實Smad4是TGF-β信號細胞內傳導的樞紐，協同TGFβ2及TβRⅡ抑制晶體上皮細胞增殖，從而誘導其發生凋亡，導致皮質性白內障的發生。

總之，TβRⅡ和smad4參與TGF-β2對晶狀體上皮細胞生長的負性調控，提示Smad4與晶狀體上皮細胞代謝、增殖、轉化有關，有助于進一步了解年齡相關性白內障發生的機制，為其預防與治療提供新的思路。