海狗丸的體外活性研究

寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012

海狗丸是由海狗、枸杞子、益智、山藥、蠶蛹和肉桂六味藥物組成的復方制劑，具有抗疲勞的保健功效。海狗丸中的君藥為海狗，本實驗所用海狗丸選用加拿大紐芬蘭養(yǎng)殖區(qū)海狗的海狗鞭入藥。海狗鞭具補腎固元、補血益氣、抗衰益壽等多種功效。

睪丸間質細胞主要功能是合成、分泌睪酮[1]，是睪丸中分泌睪酮的主要細胞，而睪酮在精子發(fā)生中起重要作用，其分泌活動主要由下丘腦、垂體及自身調節(jié)作用控制。睪丸間質細胞的研究無論在男性的生殖健康，還是機體的免疫調節(jié)，以及內分泌的調節(jié)方面都具有重要的地位[2-3]。研究結果表明：腎陽虛證患者通常存在腎上腺功能紊亂、甲狀腺功能紊亂、性腺功能紊亂、垂體功能紊亂等內分泌失調現(xiàn)象[4-6]，故將腎陽虛證定位在下丘腦-垂體-靶腺軸(腎上腺、甲狀腺、性腺)上。其中能夠反映下丘腦-垂體-性腺軸的功能異常的主要指標包括血清睪丸酮(T)下降，雙氫睪酮(DHT)降低，血清雌二醇(E2)升高[7]；同時當此性腺軸功能異常時，還會伴隨著睪丸、前列腺、精囊腺等器官出現(xiàn)組織學改變。研究采用MTT比色法和生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，考察海狗丸對大鼠的睪丸間質細胞增值及睪酮(T)分泌的影響，從細胞水平上探索海狗丸的壯陽生精活性，為海狗丸的藥效研究提供參考和依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HERAEUSHERAcell 150 CO2細胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；SW-CJ-1CU雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；METTLER TOLEDO 電子天平(SARTORIUS AG)；細胞成像倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)；Model 680型酶標儀(日本TAKARA公司)。

1.2 藥物 海狗丸(批號：B17170001，寧波御坊堂生物科技有限公司)。

1.3 動物 Wistar大鼠，SPF級，雄性，11～12周齡，體重 260～280g，許可證號：SYXK(京)2017-0022。

1.4 試劑 胎牛血清、D-MEM / F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液均購于Gibco公司；Ⅰ型膠原酶和MTT均購于Sigma公司；人絨毛膜促性腺激素(HCG)購于寧波第二激素廠；大鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫吸附測定檢測試劑盒(ELISA)購于RAD公司。

2 方法

2.1 藥物制備 將海狗丸樣品用剪刀剪碎，電子天平精密稱定0.001 g后置于1 mL容量瓶中，然后加入D-MEM /F12培養(yǎng)基溶解并定容，得到濃度為1 mg/mL的供試品溶液。再將上述供試品溶液用0.22 μm的濾膜過濾除菌，所得濾液待用且藥物制備在細胞給藥前配置。

2.2 睪丸間質細胞懸浮液的制備 依據參考文獻[8-10]結合實驗室條件進行實驗方法學研究和設計，主要研究確定了細胞離體培養(yǎng)的時間、細胞換液的時間和次數(shù)、細胞鋪板的密度、海狗丸的給藥濃度、給藥后細胞繼續(xù)培養(yǎng)的時間等實驗參數(shù)，對參考文獻方法進行改進。將Wistar大鼠用10%水合氯醛麻醉，脫椎處死后用75%乙醇浸泡10 min，置于已滅菌處理的培養(yǎng)皿中，在無菌狀態(tài)下用眼科剪和鑷剪剖開下腹，除去睪丸外層的附睪組織，取出一側完整的睪丸后，用預冷的PBS(0.01 mol/L，pH7.2)緩沖液進行沖洗后除去白膜，置0.05% I型膠原酶(約用10 mL)中輕輕吹打數(shù)次，使組織分散，37 ℃震蕩水浴消化30 min。加入等體積含10%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)液終止消化，然后用吸管吹打，使睪丸間質細胞充分散開。用4層紗布過濾，收集濾液，在1000 r/min條件下離心10 min，沉淀的細胞加入培養(yǎng)基吹打沖洗細胞中殘留的消化液，低速(1000 r/min) 離心10 min，棄上清。用含10%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)基10 mL吹打成均勻的懸浮細胞，接種于培養(yǎng)瓶中。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱條件下內培養(yǎng)36 h，待睪丸間質細胞貼壁，傾出培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗至瓶壁上沒有漂浮細胞，再加入培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，此培養(yǎng)時間是由方法學考察后確定的。

定時觀察細胞的生長狀態(tài)，選取對數(shù)期細胞用于實驗；當細胞生長到鏡下觀察覆蓋80%～90%、細胞伸展成不規(guī)則形態(tài)時，用0.25%胰蛋白酶消化液進行消化，至細胞縮成小圓形并呈現(xiàn)部分輕輕浮動現(xiàn)象時，終止消化，棄去消化液。然后向其中加入5 mL培養(yǎng)基，用吸管吹下貼壁的Leydig細胞，進行細胞活度測定后，準備鋪板。前期已對細胞鋪板密度進行考察，將細胞鋪板密度定為105個/mL。用含有10%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)液調整細胞密度至105個/mL，取100 μL/孔的細胞懸浮液接種于96孔板(鋪板)，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2 d，給藥進行實驗。

其中在細胞活力檢測階段：截取時間點分別為4 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，分別給每孔加入20 μL MTT試液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，將液體倒出，每孔加入100 μL DMSO，置于酶標儀震蕩10 min，在490 nm波長下測定吸光度，以吸光度OD值為縱坐標、時間為橫坐標，繪制睪丸間質細胞的生長曲線，如圖1所示。

由生長曲線可知：細胞處于正常生長狀態(tài)，在72 h左右，細胞處于穩(wěn)定的狀態(tài)，在24～72 h細胞基本處于對數(shù)生長期。

2.3 MTT法考察海狗丸對Leydig細胞的增殖作用

2.3.1 MTT的配制 稱取MTT0.25 g，溶于50 mL的磷酸緩沖液(PBS)，用0.22 μm濾膜過濾除菌，取實驗用量，放4 ℃避光保存?zhèn)溆谩Ｆ溆嘣跓o菌條件下，分裝1.5 mL到2 mL EP管，置-20 ℃長期保存。

2.3.2 實驗步驟 將鋪板后的睪丸間質細胞培養(yǎng)2天后，棄去培養(yǎng)液，按實驗分組對細胞進行給藥處理。樣品組每組分別加入海狗丸供試品溶液100 μL/孔(濃度分別為50 μg/mL、100 g/mL、200 μg/mL)，每個樣品濃度設5個復孔。空白對照組加入D-MEM/F12培養(yǎng)液100 μL/孔，設5個復孔。陽性組加入含人絨毛膜促性腺激素(HCG)的D-MEM/F12培養(yǎng)液(含HCG終濃度為1 U/mL)100 μL/孔，設5個復孔。在37 ℃、含5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后向每孔加入5 mg/mL的 MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h。取出培養(yǎng)板，將96孔培養(yǎng)板傾斜約30度角，小心吸去上清液后將每孔加入100 μL的DMSO，并立刻轉移至酶標儀中在37 ℃振蕩10 min后測定490 nm下的OD值[11]。

按公式計算睪丸間質細胞增值率：

細胞增殖率(%)=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/ 空白孔OD值× 100%

2.4 ELISA法測定Leydig細胞分泌的睪酮含量 參照文獻方法[12-13]進行前期方法學研究，對參考文獻方法進行改進和優(yōu)化。其中主要確定了細胞的鋪板密度，以及睪酮濃度與OD值呈線性的線性范圍。將細胞密度為105個/mL的睪丸間質細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中(100 μL/孔)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后輕輕吸去培養(yǎng)液后給藥。樣品組每組分別加入海狗丸供試品溶液100 μL/孔(濃度分別為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)，設5個復孔。空白對照組加入D-MEM/F12培養(yǎng)液100 μL/孔，設5個復孔。陽性對照組加入含人絨毛膜促性腺激素(HCG)的D-MEM/F12培養(yǎng)液(含HCG終濃度為1 U/mL)100 μL/孔，設5個復孔。給藥后置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，并檢測給藥24 h后大鼠Leydig細胞分泌的睪酮含量，按照大鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書逐步進行實驗，用酶標儀測定吸光值。

3 結果

3.1 睪丸間質細胞活性實驗結果 本實驗采用MTT法檢測Leydig細胞增殖情況，得到海狗丸3個給藥濃度對睪丸間質細胞增殖影響情況見表1。在給藥24 h后，3個給藥濃度的海狗丸樣品均對大鼠睪丸間質細胞的增殖有促進作用，且促進作用隨給藥濃度升高而增強。其中低(50 μg/mL)、中(100 μg/mL)給藥濃度的海狗丸樣品的作用不明顯，與空白對照組相比沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)；而高濃度給藥實驗組(200 μg/mL)、陽性對照組分別與空白對照組相比較，存在極顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)，說明對大鼠睪丸間質細胞增殖的促進作用強。

組別給藥濃度OD值±標準差增值率/%海狗丸實驗組200μg/mL0.75±0.02**44.2100μg/mL0.61±0.0917.350μg/mL0.56±0.117.7陽性(HCG)對照組1U/mL0.72±0.03**38.5空白對照組-0.52±0.01-

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 ELISA法測定Leydig細胞分泌的睪酮含量實驗結果

3.2.1 標準曲線的建立 利用試劑盒做睪酮標準曲線，得線性回歸方程y=0.0343x+0.6566，R2=0.9995。檢測睪酮濃度在1.0～32.0 nmol/L時與OD值呈線性關系，如圖1所示。

3.2.2 睪丸間質細胞分泌睪酮的含量 將測得的OD值用標準曲線算出睪酮含量，并與空白對照組進行獨立樣本t檢驗。結果顯示給藥24 h后，陽性對照組(HCG)和海狗丸實驗組(高、中、低3個濃度)與空白組相比，均不同程度的促進了睪丸間質細胞的睪酮分泌量，見表2。在給藥24 h后，3個給藥濃度的海狗丸樣品，均具有促進睪丸間質細胞睪酮分泌的作用，且促進作用隨給藥濃度增高而增強。分別與空白對照組相比較：其中低給藥濃度(50μg/mL)作用不明顯，無統(tǒng)計學差異(P<0.05)；中給藥濃度(100 μg/mL)就存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而在200 μg/mL高給藥濃度時，促進睪酮分泌的作用已優(yōu)于1 U/mL陽性對照(HCG)，與空白組相比較有極顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

組別給藥濃度睪酮(T)OD值±標準差含量/nmol/L海狗丸實驗組200μg/mL1.69±0.07**30.13100μg/mL1.25±0.09*17.3050μg/mL1.12±0.1313.51陽性(HCG)對照組1U/mL1.57±0.04**26.63空白對照組-1.02±0.0210.59

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

睪丸間質細胞分布于生精小管的結締組織中，主要具有合成和分泌睪酮的功能，其分泌睪酮的形式有基礎分泌和促性腺激素誘導分泌兩種。睪酮對于人類生長發(fā)育、促進性欲以及精子的生成進而提高生育力等都具有十分重要的作用。鑒于睪酮在增強人體力量、性欲、免疫等功能的重要影響，且95%的血漿睪酮是由睪丸Leydig細胞分泌的[14]，故海狗丸的壯陽生精活性與睪丸間質細胞的增值和睪酮分泌密切相關。研究采用體外培養(yǎng)睪丸間質細胞，應用不同給藥濃度的海狗丸樣品處理，觀察對睪丸間質細胞基礎分泌的變化和對細胞增殖情況的影響。

通過建立體外培養(yǎng)大鼠 Leydig 細胞的原代培養(yǎng)方法，以MTT法考察海狗丸對Leydig細胞的增殖作用，以ELISA方法檢測海狗丸對細胞培養(yǎng)上清液中睪酮含量的影響，來考察海狗丸的體外壯陽生精活性。實驗結果顯示，在設計劑量范圍內，隨著給藥濃度的增加，對大鼠睪丸間質細胞增殖的促進作用逐漸增強，其低(50 μg/mL)、中(100 μg/mL)給藥濃度的海狗丸樣品與空白對照組相比沒有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，而高濃度(200 μg/mL)給藥時就存在極顯著統(tǒng)計學差異(P< 0.01)。此外，細胞培養(yǎng)上清液中睪酮的含量也隨給藥濃度的增加逐漸增加，且與空白對照組相比，100 μg/mL、200 μg/mL給藥濃度時有統(tǒng)計學差異(P< 0.05)。由實驗結果可知，一定濃度的海狗丸細胞給藥后能促進睪丸間質細胞的增值和睪酮(T)的分泌，給藥濃度的增大其促進作用也越明顯。結果可知，海狗丸產品確實有一定的壯陽生精活性，為海狗丸的藥效研究提供參考和實驗支持。