Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化康定鼠尾草中總黃酮的提取工藝

馬志良

(藏藥研發(fā)國家重點實驗室，青海省藏醫(yī)藥研究院，西寧 810016)

康定鼠尾草(SalviaprattiiHemsl.)屬唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(SalviaLinn.) 植物，產(chǎn)于四川西部和西北部、青海省南部等地區(qū)，早在幾千年前該屬種植物就成為重要的藥用植物。唇形科鼠尾草屬植物全世界有1 000種。我國有83種，青海有3種，大多數(shù)以根入藥作丹參用[1]。其中青海省的3種分別為甘西鼠尾草、黏毛鼠尾草和康定鼠尾草[2]。鼠尾草主要含萜類、酚酸類和黃酮類等成分[3]。丹參是該屬植物的代表藥材，具有活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛和清熱安神等功效[4]。研究表明，黃酮類化合物具有抗肝臟毒性、抗炎、抗免疫、抗肝纖維化、抗菌、抗病毒和解痙攣等作用[5-14]。本實驗以康定鼠尾草莖葉為原料，對總黃酮進行超聲提取[15]，提取過程研究了乙醇體積分數(shù)和液料比等對總黃酮得率的影響，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法對主要因素進行優(yōu)化，為大批量生產(chǎn)提供科學(xué)的參考依據(jù)[16-17]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 CRAY300紫外分光光度計(美國瓦里安公司)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器科技有限公司)；MOLELEMENT元素型超純水機(上海摩勒生物科技有限公司)。

1.2試藥 康定鼠尾草采自青海省玉樹藏族自治州，經(jīng)青海省藏醫(yī)藥研究院多杰研究員鑒定為唇形科植物康定鼠尾草(SalviaprattiiHemsl.)。蘆丁(批號100080-201610)對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，無水乙醇等均為國產(chǎn)市售分析純。

2 實驗方法

2.1蘆丁最大吸收波長掃描和標準曲線 準確稱取烘干至恒質(zhì)量的蘆丁對照品10 mg，用體積分數(shù)為70%的乙醇溶解，搖勻，定容至100 mL量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。

取適量上述蘆丁對照品溶液，采用紫外分光光度法在400～600 nm掃描，確定最大吸收波長。

分別精密量取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL的上述蘆丁對照品溶液，分別置于50 mL 量瓶中，滴加質(zhì)量濃度為50 g·L-1的NaNO2溶液1 mL，再加入質(zhì)量濃度為100 g·L-1的Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，反應(yīng)6 min后加質(zhì)量濃度為400 g·L-1的NaOH 1 mL。用體積分數(shù)為75%的乙醇稀釋至刻度，顯色15 min，以空白對照作為參比，在最大吸收波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)。以吸光度值A(chǔ)和質(zhì)量濃度C進行線性回歸，并繪制蘆丁標準曲線。

2.2總黃酮的含量測定 精密稱定康定鼠尾草粉末0.5 g，加入一定量的體積分數(shù)為70%的乙醇，置于量瓶中，超聲提取2次，合并2次濾液，用體積分數(shù)為70%的乙醇稀釋至刻度。按照2.1項下方法測定總黃酮的含量。

2.3方法學(xué)考察 按照2.2項下含量測定方法進行提取實驗，采用Al(NO3)3-NaNO2法[18]分別進行精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率實驗，對康定鼠尾草總黃酮進行方法學(xué)考察。

2.4單因素實驗 按照2.2項下提取方法，先通過單因素實驗選出對康定鼠尾草中總黃酮提取率具有顯著影響的因素，確定其實驗水平。分別考察不同乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間和提取次數(shù)對康定鼠尾草中總黃酮提取率的影響。

2.5響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取超聲時間、液料比和乙醇體積分數(shù)3個提取影響較顯著的因素，根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用經(jīng)典的3因素3水平的響應(yīng)面實驗表，進行響應(yīng)面實驗，確定康定鼠尾草中總黃酮提取的最佳工藝[19-20]，實驗因素和水平見表1。

表1Box-Behnken因素與水平

Tab.1 Factors and levels in Box-Behnken design

因素水平-101X1,超聲時間/min304050X2,液料比8∶110∶112∶1X3,乙醇體積分數(shù)/%607080

3 結(jié)果

3.1蘆丁對照品的最大吸收波長和標準曲線 采用CRAY300紫外分光光度計進行掃描，蘆丁的最大吸收波長為510 nm。故在510 nm波長處測得蘆丁的線性回歸方程為：y=0.245 9x+0.035 9(r=0.999 8)，標準曲線線性關(guān)系良好。

3.2方法學(xué)考察

3.2.1精密度實驗 稱取6份康定鼠尾草樣品，每份0.2 g，按照2.2項下方法進行提取實驗，取6份濾液，分別測定吸光度值，計算RSD值為1.31%(n=6)，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

3.2.2重復(fù)性實驗 精密稱取6份康定鼠尾草樣品，每份0.2 g，按照2.2項下方法進行提取實驗，分別測定吸光度值，計算總黃酮的平均含量為7.97%，RSD值為1.53%(n=6)，結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

3.2.3穩(wěn)定性實驗 按照樣品測定方法操作，測定同一供試品溶液在不同時間的吸光度值。結(jié)果表明，顯色后30 min內(nèi)吸光度值較穩(wěn)定，隨著時間的延長，樣品吸光度值逐漸下降，故應(yīng)在顯色后30 min內(nèi)進行測定。

3.2.4回收率實驗 稱取6份康定鼠尾草樣品，每份0.1 g，按照2.2項下方法進行提取實驗，分別加入蘆丁對照品2.0 mg，制備供試品溶液，分別測定吸光度值，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2總黃酮回收率

Tab.2 Recovery rates of flavonoids

(n=6)

3.3單因素實驗結(jié)果

3.3.1提取時間對總黃酮得率的影響 在乙醇體積分數(shù)為70%、液料比為10∶1條件下進行提取實驗，考察提取時間與總黃酮得率之間的關(guān)系。根據(jù)Fick擴散定律確定在提取40 min 內(nèi)總黃酮提取率呈上升趨勢；達到一定的時間后會使擴散次數(shù)降低，總黃酮得率也隨之降低，根據(jù)實驗結(jié)果確定提取時間為40 min。

3.3.2液料比對總黃酮得率的影響 在乙醇體積分數(shù)為70%、超聲時間為40 min的條件下進行提取實驗，考察液料比和總黃酮得率之間的關(guān)系。液料比在一定范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著液料比的增加而升高，當達到一定程度后，液料比對總黃酮得率無影響。根據(jù)實驗結(jié)果確定液料比為10∶1。

3.3.3乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響 在提取1次、超聲50 min、液料比為10∶1的條件下進行提取實驗，考察乙醇體積分數(shù)和總黃酮得率之間的關(guān)系。在乙醇體積分數(shù)小于70%時，總黃酮得率隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增大，當乙醇體積分數(shù)超過70%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，總黃酮得率開始降低。根據(jù)實驗結(jié)果確定乙醇體積分數(shù)為70%。

3.3.4提取次數(shù)對總黃酮得率的影響 在乙醇體積分數(shù)為70%、超聲40 min、液料比10∶1的條件下進行提取實驗，考察提取次數(shù)和總黃酮得率之間的關(guān)系。當提取2次時，總黃酮得率呈上升趨勢，提取2次后總黃酮得率變化不大。根據(jù)實驗結(jié)果確定提取次數(shù)為2次。

3.4響應(yīng)面法分析康定鼠尾草總黃酮提取工藝

3.4.1響應(yīng)面設(shè)計方案及響應(yīng)值 從單因素實驗結(jié)果可知，提取時間、液料比和乙醇體積分數(shù)對康定鼠尾草中總黃酮得率影響較顯著，因此選取這3個因素作為影響因子，以總黃酮得率為響應(yīng)值，Box-Behnken 設(shè)計方案所得的實驗結(jié)果見表3。

經(jīng)回歸擬合后，得到以康定鼠尾草總黃酮得率為響應(yīng)值的回歸方程：總黃酮含量=-21.073+0.319X1+0.312X2+0.405X3-0.000 34X1X2+0.001 6X1X3-0.000 14X2X3-0.005X12-0.003X22-0.003 1X32。

由表4可知，提取時間與液料比的“Prob>F”值小于0.05，表明其具有明顯的影響；乙醇體積分數(shù)的“Prob>F”值大于0.05，表明其對總黃酮得率影響不顯著；整體模型的“Prob>F”值小于0.01，表明其具有明顯的影響；失擬項比F為7.60，表明其無影響；決定系數(shù)為0.954 2，表明其變量之間有顯著關(guān)系，該回歸方程可用于總黃酮得率的預(yù)測。

表3Box-Behnken設(shè)計方案及響應(yīng)值

Tab.3 Box-Behnken design proposal

編號超聲時間/min液料比乙醇體積分數(shù)/%總黃酮得率/%14012∶1805.71124010∶1706.29434010∶1706.1324408∶1805.50155010∶1805.70163012∶1705.57174010∶1706.14684012∶1605.61495010∶1605.518104010∶1706.309113010∶1804.930125012∶1705.47413508∶1705.234143010∶1605.37415408∶1605.347164010∶1706.20217308∶1705.194

3.4.2響應(yīng)面回歸模型的方差分析 見表4。

表4回歸方程方差分析

Tab.4 Analysis of variance of regression equation

參數(shù)自由度DF平方和SS均方MSFP(Prob>F)X110.0080.002 80.330.049 4X210.0010.002 10.250.046 7X310.000 970.000 970.120.983 0X1X210.000 000 40.000 000 40.000 0590.994 1X1X310.000 680.000 680.810.396 8X2X310.000 360.000 360.0420.842 5X1210.0580.0586.950.033 6X2210.0180.0182.210.180 9X3210.0250.0252.960.129 2模型90.1300.0148.660.002 2失誤項30.0140.0147.600.039 6誤差項40.0180.004 4總和160.180

3.4.3響應(yīng)曲面結(jié)果分析 各因素對響應(yīng)值的影響見圖1。其中液料比的影響最為明顯，最佳值為10∶1；另外，乙醇體積分數(shù)為70%、超聲時間為40 min時最佳。

圖1各提取因素之間的交互作用影響

Fig.1 Response surface plots showing the mutual effects of different factors on the yield of polysaccharides

3.4.4總黃酮提取工藝條件的確定 根據(jù)實驗研究選擇最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)、液料比和超聲時間分別為70.19%、10.94∶1和41.03 min，總黃酮得率可達6.24%。

4 討論

本實驗研究選擇康定鼠尾草為原料，先通過Al(NO3)3-NaNO2法對康定鼠尾草中的總黃酮進行了方法學(xué)考察。其中精密度實驗RSD值為1.31%，重復(fù)性實驗RSD值為1.53%，在顯色后30 min內(nèi)較穩(wěn)定，平均回收率為101.98%，RSD值為1.94%，結(jié)果表明，本方法精密度較高，重復(fù)性較好。

研究通過單因素實驗選擇了合適的提取工藝參數(shù)，并在此基礎(chǔ)上開展了總黃酮的最佳超聲提取工藝研究。實驗結(jié)果表明，超聲時間、液料比和乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率有明顯的影響，最佳參數(shù)為超聲時間40 min、液料比10∶1、乙醇體積分數(shù)為70%，且該方法能夠有效提高總黃酮得率，實驗所采取的提取方法可用于更多方面的探索性研究，為鼠尾草的綜合利用提供依據(jù)。