響應面法優化炮天雄多糖超聲提取工藝

陳文良，肖蘭華，朱 偉，覃 軍

(廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州 510006)

天雄為毛茛科植物卡氏烏頭(AconitumcarmichaeliDebx.)的側根，炮天雄為天雄經高溫炮制的加工品，為附子飲片商品規格之一[1-2]。《神農本草經》記載炮天雄的功效主要有溫陽、止痛和祛風。現代研究表明，炮天雄補陽補虛的功效比附子強，且毒性大大降低。炮天雄高效低毒的特性使其在嶺南、港澳、東南亞地區被廣泛作為食療藥材和保健品使用，主治元陽素虛和腎虧陽虛證[3-5]。目前，對炮天雄化學成分的研究主要是生物堿，對其他成分的研究未見。多糖作為炮天雄主要成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、增強免疫力和降血脂作用，在腫瘤、風濕性免疫疾病和心血管疾病治療等方面有很好的應用前景，具有一定的研究價值[6-8]。本文對炮天雄多糖的提取工藝進行研究,將有助于完善炮天雄的基礎理論，同時對開發和利用多糖亦有重要意義。本次實驗采用超聲輔助提取法提取炮天雄中的多糖，單因素實驗研究超聲功率、超聲時間和液料比3個因素對炮天雄多糖得率的影響，并通過響應面分析法進一步優化炮天雄多糖的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1儀器 JJ500型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；XT-A400型粉碎機(永康市紅太陽機電有限公司)；HW512型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；KQ-250DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Spectrumlab 22pc型可見分光光度計，5804R型高速冷凍離心機(上海棱光技術有限公司)。

1.2試藥 炮天雄購于廣州市藥材公司中藥飲片廠(批號YPA5A0001)，經鑒定為毛茛科植物烏頭子根的加工品。葡萄糖、濃硫酸和苯酚均為分析純，均購于廣州化學試劑廠。

2 方法

2.1供試品溶液的制備 精密稱取炮天雄粉末(過50目篩)2 g，加入一定液料比的蒸餾水，按照設定的超聲條件提取，置于80 ℃水浴鍋中放置3 h，冷卻，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清液稀釋到合適程度，作為供試品溶液。

2.2對照品溶液的制備及標準曲線的繪制 精密稱取葡萄糖對照品1.0 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，得到質量濃度為1 g·L-1的葡萄糖對照品儲備液。精密吸取上述儲備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得到質量濃度為0.1 g·L-1的葡萄糖對照品溶液。精密吸取上述葡萄糖對照品溶液0.10，0.20，0.30，0.40和0.60 mL，分別置于10 mL試管中，用水稀釋至1.00 mL，加質量濃度為50 g·L-1的苯酚水溶液1 mL，搖勻后立即加濃硫酸5.00 mL。放置冷卻，以相應試劑為空白對照，在490 nm波長處測量。以吸光度值為縱坐標(y)、葡萄糖質量為橫坐標(x)，求其標準曲線。

2.3炮天雄多糖的含量測定 取2.1項下制備的供試品溶液，加質量濃度為50 g·L-1的苯酚水溶液1 mL，搖勻后立即加濃硫酸5.00 mL。放置冷卻，以相應試劑為空白對照，在490 nm波長處測定吸光度值，通過標準曲線計算樣品多糖得率。

多糖含量=m×D×0.9

多糖得率(%)=(多糖含量/M)×100%

公式中m為標準曲線中計算的含糖量(mg)；D為稀釋倍數；0.9為葡萄糖轉換為葡聚糖的轉換系數；M為炮天雄粉末質量(g)。

2.4單因素實驗 選取超聲功率、超聲時間和液料比3個因素，分別設置3個水平進行考察，通過單因素實驗選取各因素最佳水平。

2.5響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，設計3因素3水平的響應面分析實驗，以超聲功率、超聲時間和液料比為自變量，多糖得率為響應值指標，采用Design-Expert 8.0軟件設計3因素3水平響應面實驗方案，并用其進行數據處理，以確定炮天雄多糖的最佳提取條件，見表1。

表1響應面實驗因素與水平

Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

因素水平-101超聲功率/W210240270超聲時間/min101520液料比15∶120∶125∶1

3 結果

3.1葡萄糖標準曲線 以吸光度值為縱坐標(y)、葡萄糖質量為橫坐標(x)，得回歸方程：y=9.435 1x+0.000 7，r=0.999 7，線性范圍為0.01～0.06 mg。

3.2單因素實驗結果及分析

3.2.1超聲功率對多糖得率的影響 在液料比為30∶1、超聲時間為10 min的條件下，考察不同的超聲功率180，210，240，270和300 W(超聲清洗器的最大功率為300 W，只能設定百分比)對提取炮天雄多糖的影響。結果顯示，當超聲功率小于240 W時，炮天雄多糖得率隨超聲功率的增大而逐漸增高；當超聲功率大于240 W時，炮天雄多糖得率明顯下降。因此，超聲功率在240 W最合適。

3.2.2超聲時間對多糖得率的影響 在液料比為30∶1、超聲功率為240 W的條件下，考察不同的超聲時間5，10，15，20和25 min對提取炮天雄多糖的影響。結果顯示，超聲時間小于15 min時，炮天雄多糖得率與超聲時間呈正相關，隨時間的延長而增高；當超聲時間大于15 min時，炮天雄多糖得率隨超聲時間的延長而降低。因此，超聲時間控制在15 min最合適。

3.2.3液料比對多糖得率的影響 在提取時間為10 min、超聲功率為240 W的條件下，考察不同的液料比10∶1，15∶1，20∶1，25∶1和30∶1對提取炮天雄多糖的影響。結果顯示，液料比小于20∶1時，炮天雄多糖得率明顯增高；當液料比大于20∶1時，炮天雄多糖得率反而降低。綜合考慮后續濃縮的需要，選取液料比為20∶1最合適。

3.3響應面分析法優化工藝

3.3.1響應面分析方案及結果 根據單因素實驗的結果，采用Design-Expert 8.0軟件設計實驗方案，并用其進行數據處理，響應面實驗結果見表2，回歸分析結果見表3。

表2響應面實驗設計方案與實驗結果

Tab.2 Design and results of response surface methodology

實驗號超聲功率/W超聲時間/min液料比多糖得率/%1-10141.522-1-1045.3430-1145.62410145.815-10-146.106-11042.38711044.7780-1-144.38901143.431000045.05111-1044.671210-144.771300046.141401-145.051500045.91

表3方差回歸分析結果

Tab.3 ANOVA analysis of the results

方差來源平方和自由度均方FPModel23.1192.575.520.037 2A-超聲功率2.7412.745.890.059 6B-超聲時間2.4012.405.160.072 4C-液料比1.9211.924.130.097 8AB 2.3412.345.030.074 9AC7.9017.9016.980.009 2BC2.0412.044.400.090 1A22.0212.024.350.091 5B21.6611.663.560.117 7C20.6210.621.330.300 2殘值2.3350.47- - 失擬項1.6630.551.680.394 1純誤差0.6620.33- - 總和25.4414-- -

注：P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

由表3可知，響應面模型顯著(P=0.037 2，P<0.05)，而失擬項不顯著(P=0.394 1，P>0.05)，說明干擾實驗的未知因素很少。r=23.11/25.44=0.908 4，大于0.8，表明該回歸方程的相關度較好，響應面模型與實驗結果擬合度較好。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應面之間的真實關系，可利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。在選取的因素水平范圍內，各因素對炮天雄多糖得率的影響依次為：A.超聲功率>B.超聲時間>C.液料比。

3.3.2各因素的交互作用分析 響應面分析3D曲面圖及其對應的等高線圖見圖1至圖3。由圖可知，任意2個影響因素對炮天雄多糖得率的交互影響規律。

由圖1可知，在最佳液料比為20∶1時，隨著超聲功率的增大和超聲時間的增長，炮天雄多糖得率均呈先增高后降低的趨勢。

圖1超聲功率(A)和超聲時間(B)對炮天雄多糖得率的影響

Fig.1 Effects of the ultrasonic-power (A) and ultrasonic-time (B) on extraction yield of polysaccharides from Processed Tianxiong

圖2超聲功率(A)和液料比(C)對炮天雄多糖得率的影響

Fig.2 Effects of the ultrasonic-power (A) and liquid-solid ratio (C) on extraction yield of polysaccharides from Processed Tianxiong

圖3超聲時間(B)和液料比(C)對炮天雄多糖得率的影響

Fig.3 Effects of the ultrasonic-time (B) and liquid-solid ratio (C) on extraction yield of polysaccharides from Processed Tianxiong

由圖2可知，在最佳超聲時間為15 min時，隨著超聲功率和液料比的增大，炮天雄多糖得率均呈先增高后降低的趨勢，且可以看到超聲功率和液料比的交互作用極顯著(P<0.01)。

由圖3可知，在最佳功率為240 W時，隨著超聲時間的延長和液料比的增大，炮天雄多糖得率均呈先增高后降低的趨勢。

3.3.3最佳提取條件的確定 根據Design-Expert 8.0軟件數據分析結果，炮天雄多糖的最佳提取條件為超聲功率269.97 W，超聲時間13.20 min，液料比25∶1，在此條件下，炮天雄多糖得率為46.14%。考慮到實驗設備的局限性和實驗操作的方便性，將優化參數進行修正，即得到超聲功率270 W，超聲時間13 min，液料比25∶1。根據修正條件進行實驗，得到炮天雄多糖的實際得率為45.91%，與理論值相近，說明擬合效果較好。

4 討論

多糖是由醛糖或酮糖通過苷鍵連接在一起的多聚物，廣泛存在于植物、動物和微生物中，是構成生命的四大基本物質之一[9-10]。響應曲面法是以較少實驗次數和較短時間對所選的實驗參數進行全面研究的工藝優化策略，集統計學、數學建模和計算機科學為一體。與正交實驗優化法相比，響應曲面法不僅能獲得最佳的工藝參數，更能全面考察各因素之間的相互影響[11-14]。本實驗采用超聲輔助熱水浸提法提取炮天雄多糖，通過單因素實驗，在選取的因素水平范圍內，各因素對炮天雄多糖得率的影響依次為：超聲功率>超聲時間>液料比，得出其最佳提取條件為：超聲功率240 W，超聲時間15 min，液料比20∶1。用響應面分析法進行進一步的優化并修正的結果為：超聲功率270 W，超聲時間13 min，液料比25∶1，炮天雄多糖的理論得率為46.14%，實際得率為45.91%，此回歸模型預測各因素與得率間的關系比較可靠，響應面法優化炮天雄多糖超聲提取的工藝可行。

炮天雄為附子飲片的一種規格，但因炮天雄選材和炮制工藝的不同，導致炮天雄的功效和性質與附子不同，炮天雄選的是附子個大質量較好的，所含有效成分較高，炮制時不用切片，減少有效成分的流失，因此炮天雄補陽補虛的功效比附子強，實驗數據表明，炮天雄單酯型生物堿含量較高，毒性成分雙酯型生物堿含量偏低，說明炮天雄有高效低毒的特性，用于臨床更為安全可靠[15-19]。但目前，在大陸對炮天雄的使用較少，對炮天雄成分的研究很多都是處于空白階段，沒有建立完善的活性成分系統和質量標準，本文所建立的炮天雄多糖提取工藝對其質量研究與推廣使用很有意義。