育亨賓樹皮中育亨賓提取工藝研究

張 敏，閆高穎，張必榮，王 平，任曉峰

(1.陜西天谷生物科技集團有限公司，西安 710065；2.漢中天然谷生物科技股份有限公司，漢中 723100)

育亨賓(yohimbine)是一種有興奮作用的天然單萜吲哚類生物堿，其化學結構為17-α-羥基育亨賓-16-α-羧酸甲酯(methyl 17-α-hydorxy-yohimban-16-α-carboxylate)[1]，最早從西非茜草科育亨賓樹(Corynantheyohi-mbeK.Schum)的干皮中提取[2]，樹皮中總生物堿質量分數為6.1%，其中育亨賓堿占總生物堿的10%～15%[1]。在非洲育亨賓以樹皮入藥，可在一年中的任何時候采集，作為催欲藥的使用歷史悠久[2]。我國夾竹桃科植物蘿芙木屬(Rauvlfia)根中含有少量育亨賓，據報道，以云南景洪產的蘿芙木中育亨賓含量較其他產區高[3-4]。現代藥理研究表明，育亨賓作為一種有效的α2-腎上腺素受體拮抗劑[5]，在治療男性性功能障礙方面作用顯著，被認為是治療陽痿的有效藥物[6]，同時該活性物質具有擴張外周血管、降低血壓[7-8]和消炎[9-12]等作用。目前對育亨賓的研究主要集中在檢測方法[13-15]、藥理學[16]和藥效學[17-18]等方面，對育亨賓的提取工藝報道較少。雷智東等[19]以鹽酸育亨賓為定量檢測指標，通過正交實驗考察了提取溶劑、料液比和提取時間3個因素對鹽酸育亨賓提取率的影響；郭占京等[20]以廣西產的蘿芙木為原料，采用響應面優化超聲波輔助提取法，以育亨賓提取量為響應值，選取粒度、提取液pH值、提取時間和料液比為自變量，考察育亨賓的工藝條件，該工藝下的參數對以育亨賓樹皮為原料提取的有效物質含量和穩定性有待考察。本研究以育亨賓為含量檢測指標，全面考察提取溶劑、料液比、提取時間和提取溫度等因素對育亨賓提取率的影響，用正交實驗設計，優化育亨賓最佳提取工藝，為育亨賓提取物的工業化生產提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 HH-S4型數顯恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；BP25S 型電子天平(德國賽多利斯公司)；TQ-100型高速萬能粉碎機(永康市天祺盛世工貿有限公司)；高效液相色譜(Thermo Ultimate 3000型四元泵、二極管陣列檢測器、自動進樣器)(賽默飛世爾科技有限公司)；Q型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Maxima超純水機(美國基因公司)。

1.2試藥 育亨賓樹皮購自西安市萬壽路藥材市場經陜西中醫藥大學藥學院生藥教研室鑒定為非洲植物育亨賓樹CorynanteYohimbeK.Schum的干燥樹皮；育亨賓對照品(美國Sigma公司，批號BR-04484)；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1育亨賓的含量測定

2.1.1色譜條件及系統適用性實驗 色譜柱：Thermo TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈(5∶1，pH值為4.0)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，育亨賓對照品和樣品色譜圖見圖1。結果表明，樣品中的育亨賓與其他組分達到了基線分離，分離度大于2.0。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.樣品；C.陰性對照品；1.育亨賓。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances；B.sample；C.negative control;1.yohimbine.

2.1.2對照品溶液的制備 精密稱取1 mg育亨賓對照品，用體積分數為90%的甲醇充分溶解并定容至1 mL量瓶中，搖勻，即得質量濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 稱取干燥粉碎后的育亨賓樹皮粗粉1.0 g，置于100 mL量瓶中，加入50 mL體積分數為 90%的甲醇溶解，超聲提取30 min，冷卻至室溫，定容至100 mL，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冷藏備用。

2.1.4陰性對照品溶液的制備 取空白樣品，按照2.1.3項下方法制備。

2.1.5線性關系考察 吸取2.1.2項下制備的育亨賓對照品溶液適量，分別稀釋成質量濃度為800，400，200，100，50和10 μg·mL-1的系列對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冷藏備用。按照2.1.1項下色譜條件連續進樣10 μL，分別重復3次，記錄峰面積。以對照品質量濃度(x)對峰面積(y)進行回歸分析，得回歸方程y=2.232 7x-3.913 6(r=0.999 9)。育亨賓質量濃度在10～800 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.1.6精密度實驗 精密吸取育亨賓對照品溶液10 μL，按照2.1.1項下色譜條件連續進樣6次，測定育亨賓峰面積的RSD值為0.8%，結果表明，精密度良好。

結合學生已經掌握的理論知識和實踐技能，我們可以借助于“項目”任務，來強化學生對知識、技能的復合應用。旅游管理涵蓋的現實問題較多，通過“項目”研究教學模式，以“多問題、多前提、多變量”為項目分析思路，將學生進行分組，鼓勵各組學生合作、探究，解決問題。該模式需要強調：一是“項目”難度的把控，要適當；二是“項目”劃分要體現小組合作研究，強調學生間的配合；三是突出“項目”完成成果形式，可以是研究報告、論文、對策建議等。

2.1.7穩定性實驗 取2.1.3項下制備的供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，6，8，10和12 h進樣，測定育亨賓的峰面積RSD值為0.9%，結果表明，供試品溶液在12 h內穩定。

2.1.8重復性實驗 取5份2.1.3項下制備的供試品溶液5份進行測定，育亨賓峰面積的RSD值為2.5%，結果表明，樣品重復性良好。

2.1.9回收率實驗 精密稱取5份已知含量的育亨賓樹皮粗粉0.1 g，分別置于10 mL量瓶中，加入1 mg對照品溶液，按照2.1.1項下色譜條件進樣，平均回收率為103.40%，RSD值為0.85%。

2.2樣品測定 按照2.1.3項下方法制備供試品溶液；分別精密吸取對照品與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，連續平行測定3次，記錄峰面積，按照標準曲線法計算育亨賓含量。結果育亨賓的含量分別為6.23%，6.19%和6.26%，平均含量為6.23%，RSD值為0.56%。

2.3單因素實驗

2.3.1提取溶劑種類的確定 稱取2 g育亨賓粗粉，4份，分別溶于10 mL質量濃度為1 g·L-1的酒石酸、質量濃度為1 g·L-1的檸檬酸、體積分數為0.1%的醋酸和質量分數0.1%的鹽酸中，料液比為1∶22，100 ℃回流提取3次，每次1.5 h，計算育亨賓的收率，確定最佳提取溶劑，結果顯示，以育亨賓的收率為指標成分，對4組提取溶劑進行考察，隨著提取溶劑酸性的增強，育亨賓的收率呈上升趨勢；當提取溶劑為質量分數0.1%的鹽酸時，收率可達106.6%。故選擇質量分數為0.1%的鹽酸作為提取溶劑。

2.3.2提取溶劑質量分數的確定 稱取2 g育亨賓粗粉5份，分別溶于10 mL質量分數分別為 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%的鹽酸溶液中，料液比為1∶22，100 ℃回流提取3次，每次1.5 h，計算育亨賓的收率，確定最佳提取溶劑質量分數，結果顯示，以育亨賓的收率為指標成分，對不同質量分數的鹽酸進行考察，當鹽酸的質量分數為0.2%時，收率可達最大值107.5%；而后隨著提取溶劑質量分數的增大，育亨賓的收率呈下降趨勢，推測強酸破壞了目標成分育亨賓的溶出，影響了育亨賓的提取效果，故選擇提取溶劑為質量分數為0.2%的鹽酸。

2.3.3料液比的確定 稱取2 g育亨賓粗粉4份，溶于10 mL質量分數為0.2%的鹽酸溶液中，分別在料液比為1∶20，1∶22，1∶26和1∶28的條件下，100 ℃回流提取3次，每次1.5 h，計算育亨賓收率，確定最佳料液比，結果顯示，以育亨賓的收率為指標成分，對不同料液比進行考察，隨著料液比的增加，育亨賓的收率呈上升趨勢，但當料液比從1∶22上升到1∶28時，收率增加緩慢，綜合考慮，選擇料液比為1∶22。

2.3.4提取時間的確定 稱取2 g育亨賓粗粉5份，分別溶于10 mL質量分數為0.2%的鹽酸溶液中，在料液比為1∶22的條件下，提取時間分別為3.0，2.5，2.0，1.5和1.0 h，100 ℃回流提取3次，計算育亨賓收率，確定最佳提取時間，結果顯示，以育亨賓的收率為指標成分，對提取時間進行考察，當提取時間從1 h增加到2 h時，育亨賓的收率呈明顯上升趨勢；當提取時間從2 h增加到3 h時，育亨賓的收率呈明顯下降趨勢。當提取時間為2 h時，育亨賓的收率達到最大值103.7%，因此選擇提取時間為2 h。

2.3.5提取溫度的確定 稱取2 g育亨賓粗粉，5份，分別溶于10 mL質量分數為0.2%的鹽酸溶液中，料液比為1∶22，每次1.5 h，回流提取3次，在提取溫度為60，70，80，90和100 ℃條件下，計算育亨賓收率，確定最佳提取溫度，結果顯示，以育亨賓的收率為指標成分，對提取溫度進行考察，隨著提取溫度的升高，育亨賓的收率呈明顯上升趨勢；當提取溫度為100 ℃時，育亨賓的收率達到最大值106.9%，因此選擇提取溫度為100 ℃。

2.4正交實驗 根據單因素的實驗結果，選取提取溶劑質量分數(A)、提取溫度 (B)、料液比(C)和提取時間(D)為主要因素，每個因素各選取3個水平，以育亨賓含量為考察指標，設計L9(34)正交實驗確定最佳提取工藝，正交實驗因素水平見表1至表3。

表1正交實驗的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平因素A,提取溶劑質量分數/%B,提取溫度/℃C,料液比D,提取時間/h10.1801∶221.520.2901∶262.030.31001∶282.5

由表2可知，育亨賓含量為育亨賓提取工藝的考察指標，由極差R可知，各因素的影響程度依次為A>B>C>D。由表3可知，因素A(提取溶劑的質量分數)對育亨賓的提取有極顯著性意義，因素B(提取溫度)對育亨賓的提取有顯著性意義，因素C和因素D對提取無顯著性意義，可根據生產條件任取一水平，從節約能源和提高生產效率方面考慮，料液比為C1(1∶22)，提取時間為D1(1.5) h，得出較佳提取工藝，即 22倍量的水(1∶10∶6∶6)，100 ℃條件下提取3次，每次1.5 h。

2.5驗證實驗 根據正交實驗結果，稱取適量育亨賓粗粉3份，按照最終選取的工藝進行提取，育亨賓的平均收率大于103%。

表2正交實驗結果

Tab.2 Results of the orthogonal experiment

編號ABCD育亨賓含量/%111115.99212226.06313336.24421236.49522316.87623127.23731325.93832136.15933216.32K118.2918.4119.3719.18K220.5919.0818.8719.22K318.4019.7919.0418.88Ⅰ6.0976.1376.4576.393Ⅱ6.8636.3606.2906.407Ⅲ6.1336.5976.3476.293R0.7670.4600.1670.113

表3方差分析結果

Tab.3 Results analysis of variance

方差來源離差平方和自由度FFα顯著性A1.122248.78F0.1=9**B0.317213.78F0.05=19*C0.04321.87D0.02321.00誤差02

注：*P<0.1為有極顯著性意義，**P<0.05為有顯著性意義。

3 討論

本研究考察了提取溶劑、提取溶劑的質量分數、料液比、提取時間和提取溫度5個因素對育亨賓提取率的影響，育亨賓樹皮中有效物質以生物堿的形式存在，采用酸提取增加其溶解性，篩選出以鹽酸為提取溶劑，進一步通過正交實驗優化提取工藝，得到了育亨賓樹皮中提取育亨賓的最佳提取條件為：質量分數為0.2%的鹽酸溶液，料液比為1∶22，提取溫度為100 ℃，提取3次，每次1.5 h，經工藝驗證，育亨賓的平均提取率高于103%，表明本提取方法提取率高于現有報道[19]，且本研究所確定的育亨賓含量測定方法操作簡單、重復性好，在生產過程中作為質量控制方法可行，該提取工藝穩定，已應用到育亨賓提取物的工業化生產中。