兩色金雞菊提取物中3種黃酮苷在大鼠胃腸道的水解代謝研究

韓海霞，朱金芳，王 娟，蔣惠娣

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052；2.浙江大學藥學院，杭州 310058)

兩色金雞菊為菊科(Compositae)金雞菊屬植物兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)的干燥頭狀花序，以新疆南疆的和田地區為其主要生產區。《新華本草綱要》記載：兩色金雞菊，味甘、性平，歸肝、大腸經，功效清熱解毒、化濕止痢[1-2]。現代藥效學研究表明，兩色金雞菊提取物具有降血壓[3]、降血脂[4]、抗炎[5]、降血糖[6]和心肌保護[7]等作用，其化學成分主要以黃酮類化合物為主[8-9]，本研究已從中分離鑒定出馬里苷(CCT-1)、異奧卡寧-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CCT-2)和花旗松素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CCT-3)等黃酮苷類物質[10]，結構見圖1。

很多黃酮苷類物質可被胃腸道菌群中的酶水解代謝生成苷元，并發揮藥理作用[11-12]，也是導致某些黃酮類物質的吸收和生物利用度低的重要原因[13]。但這些代謝酶在胃腸道各段組織中分布不同，具有底物選擇性，所以糖種類、苷元類型和糖苷鍵的位置在很大程度上導致黃酮苷代謝的差異[14-15]。兩色金雞菊提取物中3個黃酮苷CCT-1、CCT-2和CCT-3含量依次為18.3%，7.6%和1.8%，且均被證明具有顯著抗氧化活性[16]，CCT-1還被證明是兩色金雞菊防治糖尿病的重要成分[17-18]。本文建立此3種黃酮苷的苷元(奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素)的HPLC測定方法，應用胃腸道組織提取物體外孵育法，測定三者的質量濃度，研究兩色金雞菊中3種黃酮苷在腸道是否發生水解代謝及代謝程度。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1260型液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Centrifuge 5415 R型低溫離心機(德國Eppendorf公司)；IKAT10 basic型電動組織勻漿機(德國IKA公司)；AL104-S電子分析天平，320 pH計(瑞士Mettler Toledo公司)；GBL-88B渦旋震蕩儀(海口其林貝爾儀器制造有限公司)；HH-2型數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

圖1黃酮苷及其苷元的化學結構

1.馬里苷(CCT-1);2.奧卡寧；3.異馬里苷(CCT-2)；4.異奧卡寧；5.花旗松素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CCT-3)；6.花旗松素。

Fig.1 The chemical structures of flavonoid glycosides and their aglycones

1.marein (CCT-1)；2.okanin；3.flavanomarein (CCT-2)；4.isookanin；5.taxifolin-7-O-β-D-glucopyranoside (CCT-3)；6.taxifolin.

1.2試藥 CCT-1、CCT-2、CCT-3、奧卡寧和異奧卡寧(均為實驗室自制，經UV法、1H-NMR法、13C-NMR法和 Q-TOF法結構鑒定，并應用HPLC法測定質量分數均≥98.5%)；花旗松素(質量分數為98%，HPLC級，南京蘇郎生物科技有限公司)；甲醇為色譜純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙腈為色譜純(美國天地有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.13種黃酮苷元的對照品溶液和質控溶液 精密稱取奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素適量，用DMSO溶解，分別配制成質量濃度均為30.0 mg·mL-1的儲備液；精密移取適量儲備液混合，用體積分數為50%的甲醇逐步稀釋得到質量濃度分別為0.15，0.3，0.6，2.4，9.6和19.2 g·mL-1的對照品溶液；同法制得質量濃度分別為0.15，0.3，9.6和15.0 g·mL-1的質控溶液。

2.2色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；以1 mL·L-1甲酸(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫(0～2.5 min，10%B～16.5%B；2.5～5.0 min，16.5%B～34%B；5.0～5.1 min，34%B～50%B；5.1～7.0 min，50%B～50%B；7.0～7.1 min，50%B～16%B；7.1～10 min，16%B～16%B)；柱溫：30 ℃；檢測波長:380 nm(CCT-1，奧卡寧)、284 nm(CCT-2，異奧卡寧；CCT-3，花旗松素)；流速:1.0 mL·min-1；進樣體積：5 μL；分析時間：10 min。

2.3大鼠胃腸道組織提取物的制備 大鼠斷頭處死，迅速取出胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸和盲腸，用生理鹽水沖洗，加磷酸鹽緩沖溶液 (10 mmol·L-1,pH值為7.0)，制備勻漿，勻漿液離心，上清液即為組織提取物，分裝后于-80 ℃保存備用。BCA法測定蛋白質量濃度[19]。

2.4黃酮苷在組織提取物中的孵育 取適量組織提取物與磷酸鹽緩沖溶液，混勻，加黃酮苷溶液適量，反應終體系為100 μL(甲醇含量不得超過1%)，于37 ℃孵育。加乙腈200 μL，渦旋，離心，取上清液100 μL，進樣，用于HPLC分析。

2.5CCT-1、CCT-2和CCT-3去糖基代謝率的計算 以胃腸道組織提取物孵育液中測得的黃酮苷元質量濃度換算發生去糖基代謝的黃酮苷質量濃度，求得黃酮苷去糖基代謝率(%)=Ci/C0×100%，Ci為發生去糖基代謝的黃酮苷質量濃度，C0為反應體系中加入的黃酮苷初質量濃度。

2.6HPLC方法學考察

2.6.1奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在孵育體系中的選擇性 見圖2。由圖2可知，在本色譜條件下，在380 nm波長處檢測奧卡寧，在284 nm波長處檢測異奧卡寧和花旗松素，三者峰形良好，孵育體系中相關物質不干擾三者測定，奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素的出峰時間依次為7.1，6.3和6.5 min。

2.6.2奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在組織提取液中的標準曲線和線性關系 按照2.1和2.4項下方法進行操作，取上清液進行HPLC分析，各質量濃度進行3樣本分析，記錄色譜圖。以分析物的質量濃度為橫坐標(x)、分析物的峰面積為縱坐標(y)，進行回歸運算，制得標準曲線。結果表明，奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素均在0.15～19.2 μg·mL-1范圍內線性良好(r≥0.999)。

2.6.3奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在組織提取液中的回收率 按照2.1項下方法配制奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素的質控溶液，按照2.4項下方法處理樣品溶液，取上清液進行HPLC分析，各質量濃度進行5次樣本分析，記錄色譜圖中奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素的峰面積Ai，另取以初始流動相直接配制相同理論質量濃度的奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素溶液，同法進樣，記錄峰面積A0，絕對回收率=Ai/A0×100%。結果表明，奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在組織提取液中的絕對回收率在85.1%～100.7%之間。

圖2組織提取液中奧卡寧、異奧卡寧、花旗松素的HPLC圖

A.空白樣品；B.對照樣品；C.被測樣品；1. 奧卡寧; 2.異奧卡寧; 3.花旗松素。

Fig.2 HPLC chromatograms of okanin，isookanin，taxifolin in cell free fractions

A.blank; B.control samples; C.measured samples；1.okanin; 2.isookanin; 3.taxifolin.

2.6.4奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素在組織提取液中的精密度 按照2.6.3項下方法操作，各質量濃度進行5次樣本分析。將奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素的峰面積代入標準曲線。結果表明，日內精密度(RSD)在1.4%～12.8%之間，日間精密度(RSD)在1.8%～14.7%之間，表明該方法精密度符合要求。

2.7孵育體系中底物質量濃度、酶質量濃度及孵育時間的選擇 見圖3。由圖3A可知，質量濃度為4.5～144.0 μg·mL-1CCT-1、CCT-2、CCT-3與蛋白質量濃度為1.5 mg·mL-1的組織提取物孵育30 min，產生的奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素隨底物質量濃度的增加而增加。因此，本實驗選擇底物質量濃度為36.0 μg·mL-1。由圖3 B可知，酶蛋白質量濃度在0.75～1.5 mg·mL-1范圍內與CCT-1、CCT-2和CCT-3孵育30 min，產生的奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素質量濃度呈線性上升趨勢，因此，選擇酶質量濃度為1.5 mg·mL-1。由圖3C可知，酶蛋白溶液與CCT-1、CCT-2和CCT-3孵育20～45 min，產生的奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素呈線性增加，因此確定孵育時間為45 min。

2.8大鼠胃腸道不同部位對黃酮苷水解代謝的影響 在2.7項下優化的孵育條件下，考察黃酮苷在大鼠胃腸道不同部位提取物中的水解代謝率。結果見圖4。CCT-1、CCT-2和CCT-3在大鼠小腸提取物中均能發生水解代謝，生成相應的苷元奧卡寧、異奧卡寧和花旗松素，但在胃、結腸和盲腸中不能發生水解代謝。CCT-1、CCT-2和CCT-3在空腸和回腸中的去糖基代謝率高于十二指腸中的代謝率，分別為61.8%～64.8%，29.7%～35.3%和13.7%～20.5%。

圖3孵育體系中底物質量濃度(A)、酶質量濃度(B)及孵育時間(C)對黃酮苷水解代謝的影響(n=3)

Fig.3 Effect of substrate concentration (A)，protein concentration (B) and incubated time (C) on the hydrolyzed metabolism of flavone glycosides in incubation system (n=3)

圖4CCT-1、CCT-2和CCT-3在大鼠胃腸道組織提取物中的代謝率(n=6)

Fig.4 Hydrolyzation ratio of CCT-1，CCT-2 and CCT-3 in cell-free extract from rat gastrointestinal tract (GIT)(n=6)

3 討論

文獻報道，黃酮苷元母核類型、糖類型、糖與苷元連接的位置與數量等均可影響黃酮苷去糖基代謝的程度[14]。CCT-1、CCT-2和CCT-3基本母核分別屬于查爾酮類(CCT-1)、二氫異黃酮類(CCT-2)和黃酮醇類(CCT-3)。由去糖基代謝實驗結果可知，3個黃酮苷在胃腸道中的去糖基代謝程度有很大差異，在大鼠組織提取物中，去糖基代謝程度由高到低依次為CCT-1>CCT-2>CCT-3，這可能是由腸道酶對3種黃酮苷的去糖基代謝具有底物選擇性所致。有研究報道，落新婦苷(花旗松素-3-O-鼠李糖苷)口服給藥后，血漿中并未檢測到其苷元花旗松素[20]，而本文證實CCT-3(花旗松素-7-O-葡萄糖苷)能在胃腸道發生去糖基代謝，異槲皮苷(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)能在胃腸道去糖基代謝生成異槲皮素而吸收，而金絲桃苷(槲皮素-3-O-半乳糖苷)卻以糖苷的形式吸收入血[15]，這些都驗證了去糖基代謝酶的底物選擇性。本研究體外孵育實驗表明，兩色金雞菊中CCT-1、CCT-2和CCT-3均可被胃腸道黏膜水解酶代謝為相應苷元，CCT-1的去糖基代謝程度最大，最弱的是CCT-3，提示兩色金雞菊進入體內后，其苷和水解代謝生成的苷元均有可能為有效成分之一，該結果為兩色金雞菊藥效物質基礎的研究提供理論依據。