載異煙肼納米粒的制備及其體外抗結核活性研究

萬月強，王新宏，郭 珍，王麗萍，賈 斐

(陜西省結核病防治院內二科，西安 710100)

結核病(tuberculosis，TB)是一種由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的傳染性疾病，主要傳播途徑為空氣-呼吸道[1-2]。目前，我國結核病年發病人數約為130萬，占全球發病人數的14%，位居全球第2位[3-4]。有效的抗結核化療是結核病臨床治療的核心和關鍵，其中異煙肼(INH)是世界衛生組織(WHO)推薦的結核治療方案中的一線主藥之一[5-6]。但由于結核病的治療聯合藥物多、療程長、藥物不良反應常見等，患者的藥物依從率低，是結核病治療失敗或復發、結核桿菌耐藥十分重要的原因。如何提高結核病治療的藥物依從率是各國研究者都要面對的問題。

藥物的選擇性分布改進了傳統的給藥方式，利用遞藥系統的靶向性使藥物富集于靶器官，從而提高了藥物的生物利用度及治療效果，可降低毒性和不良反應[7-8]。近年來關于納米遞藥系統的研究獲得了重大進展。相對于傳統劑型，載藥靶向微粒的優勢體現在：①靶部位可維持較高藥物濃度，且持續時間長；②提高藥物相對生物利用度；③降低藥物毒性和不良反應，提高治療指數；④降低給藥次數，提高患者依從性[9-10]。如能通過改變現有的抗結核藥物的劑型，從而使藥物達到釋控釋和局部聚集的目的，對減輕藥物毒性和不良反應以提高臨床應用效果具有特別重要的意義。Ahmad Z等[11]利用復乳溶劑揮發法制備了益康唑及莫西沙星PLGA載藥納米粒，該納米粒在小鼠靶器官內緩釋可達6 d，而游離益康唑及莫西沙星在12～24 h后被靶器官清除。由于納米遞藥系統的獨特性，因此在抗結核藥物的靶向給藥、藥物控釋及緩釋等研究領域具有廣闊的應用前景。

葡聚糖是一種天然多糖，具有安全無毒、無免疫原性和生物可降解等優點，被廣泛應用于生物醫學領域[12-14]。此外，葡聚糖能夠有效延長遞藥系統在體內的循環時間，增加藥物在病變部位的蓄積[15]。基于文獻研究基礎，緊跟國內外在制劑學方面的進展，本研究擬以葡聚糖(DEX)為親水性材料，以辛胺(OA)為疏水性材料，設計制備一種載INH的納米粒載藥系統。以透析法制備INH-DEX-OA，通過單因素實驗對其制備工藝進行優化，并對納米粒進行表征，進而考察納米粒INH-DEX-OA的體外釋藥特性及體外抗結核活性，以期制備一個安全有效的載INH遞藥系統。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥 恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市科協儀器有限公司)；JN-900D 超聲波細胞破碎儀(寧波江南儀器廠)；H-600-4 透射電子顯微鏡(日本 HITACHI公司)；Agiuent1200高效液相色譜系統(美國安捷倫科技有限公司)；Zeta電位及激光粒度分析儀(美國Beckman Coulter公司)；凍干機(美國GOLD-SIM公司)。葡聚糖(DEX-5000)、3,3-二硫二丙酸(DPC)和辛胺(OA)購自北京百靈威公司；利福平(INH)購自武漢富馳生物科技有限公司；其他試劑均購自西安科昊生物工程有限責任公司。

1.2方法

1.2.1二硫二丙酸-辛胺(DPC-OA)的合成 DPC-OA的合成路線見圖1。在20 mL的1,4二氧六環中加入500 mg的DPC以及916.8 mg的EDCI，攪拌30 min，加入575.2 mg的NHS和150 μL的TEA，繼續攪拌活化3 h，隨后在反應液中加入217.6 mg的OA，反應12 h，TLC監測，反應結束后過柱分離獲得產物。展開劑：二氯甲烷∶甲醇(10∶1)。

圖1DPC-OA的合成路線

Fig.1 The synthetic route of DPC-OA

1.2.2葡聚糖-辛胺(DEX-OA)的合成 合成路線見圖2。將一定量的DPC-OA、EDCI、NHS和TEA分別溶于DMSO中，充分溶解后加入DEX，反應12 h。結束反應后，過濾反應液，得淡黃色澄清液體，濾液用大量二氯甲烷沉淀，并反復用二氯甲烷清洗沉淀，甲醇潤洗沉淀2次，隨后將沉淀溶于蒸餾水中透析凍干，即得DEX-OA。通過1H-NMR和IR方法對合成的產物進行結構表征。

圖2DEX(5K)-DPC-OA的合成路線

Fig.2 The synthetic route of DEX(5K)-DPC-OA

1.2.3載藥納米粒的制備工藝優化 (1)溫度的影響:稱取2 mg INH置于4 mL的DMSO中，分別在20，40，60 和80 ℃油浴中避光磁力攪拌1 h使其充分溶解；加入10 mg的DEX-OA，繼續攪拌2 h后滴加32 mL蒸餾水，持續攪拌12 h。反應結束后，將反應液裝入相對分子質量截留量為2 000的透析袋中，透析48 h。透析后冷凍干燥得載藥納米粒INH-DEX-OA。

(2)蒸餾水用量的影響:將2 mg INH溶于4 mL DMSO，60 ℃油浴中攪拌1 h使其充分溶解。隨后加入10 mg的DEX-OA，繼續攪拌2 h，最后分別緩慢滴加8，16，32和64 mL蒸餾水，攪拌12 h。反應結束后，將反應液裝入相對分子質量截留量為2 000的透析袋中，透析48 h。透析后冷凍干燥得載藥納米粒INH-DEX-OA。

(3)投藥量的影響:分別稱取1，2，3 和4 mg的INH溶于4 mL DMSO中，在60 ℃油浴中避光磁力攪拌1 h使其充分溶解。隨后加入10 mg的DEX-OA，持續攪拌2 h后緩慢滴加32 mL蒸餾水，持續攪拌12 h。反應結束后，將反應液裝入相對分子質量截留量為2 000的透析袋中，透析48 h。透析后冷凍干燥得載藥納米粒INH-DEX-OA。

1.2.4載藥納米粒的表征 (1)納米粒INH-DEX-OA載藥量與包封率的測定：精密稱取一定量的納米粒，甲醇溶解后定容，采用HPLC法測定異煙肼的質量濃度。色譜條件：COSMOSIL 5C18-PAQ色譜柱(250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈∶水(30∶70)；檢測波長為330 nm；柱溫為35 ℃。根據測定結果計算異煙肼的載藥量。

載藥量=(納米粒中藥物量÷納米粒的量)×100%

包封率=(納米粒中包封的藥物量÷制備納米粒投入的藥物總量)×100%

(2)納米粒INH-DEX-OA粒徑與Zeta電位的測定：稱取一定量的載藥納米粒溶于蒸餾水中，制備質量濃度為1 mg·mL-1的納米粒溶液，利用0.22 μm濾膜過濾，用納米粒度分析儀測定納米粒粒徑和Zeta電位，測定3次取平均值。

(3)載藥納米粒形態觀察：TEM觀察納米粒的外觀形態：配制質量濃度為0.5 mg·mL-1的納米粒溶液，利用0.22 μm濾膜過濾，滴于銅網膜上，處理后通過TEM觀察。

1.2.5納米粒INH-DEX-OA體外釋藥研究 稱取2 mg載藥納米粒溶于10 mL的PBS(pH 7.4)緩沖液中，隨后裝入相對分子質量截留量為2 000的透析袋中，置于孵育液中，于37 ℃恒溫搖床中振蕩透析。間隔一定時間吸取透析袋外液，用HPLC法檢測。以INH的累積釋放量為縱坐標，時間為橫坐標，繪制釋藥曲線。

1.2.6體外抗結核分枝桿菌活性 采用平皿二倍稀釋法測定游離INH與納米粒INH-DEX-OA的最低抑菌濃度(MIC)。在無菌平皿內加入1 mL 藥液，再加MH培養基14 mL，混勻，使其藥物終質量濃度分別為 128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.12，0.06和0.03 mg·L-1；冷卻后接種細菌，菌量為105cfu·mL-1。隨后將無菌平皿置于37 ℃培養箱內孵育24 h，測定結果。

2 結果

2.1聚合物材料DEX-OA的結構表征 聚合物材料DEX-OA經凍干后得白色疏松狀固體。采用1H-NMR對其進行測定。結果見圖3A，OA的特征質子峰為2.32，1.51和0.98 ppm，DEX的特征質子峰為5.12，4.76，4.58以及3.0～3.8 ppm。結果表明，OA成功連接在DEX的長鏈上。IR對合成材料DEX-OA進行表征。結果見圖3B，1 737 cm-1處是酯鍵C=O的伸縮振動特征峰，1 618 cm-1處是酰胺鍵C=O的伸縮振動特征峰，而1 655 cm-1處是DEX的氫鍵H-O-H所產生特征吸收峰。以上結果證實合成材料DEX-OA為目標材料。

2.2納米粒制備工藝優化 溫度變化對納米粒的影響見表1。隨著溫度的升高，納米粒INH-DEX-OA的粒徑變小且分布更均一。在制備溫度為60 ℃時，納米粒的粒徑約為90 nm，PDI為0.13；當溫度增加至80 ℃時，納米粒粒徑大小與60 ℃時相近。因此最終選擇溫度為60 ℃。

圖3DEX-OA的1H-NMR(A)和IR(B)圖譜

Fig.31H-NMR (A) spectrum and IR spectrum (B) of DEX-OA

表1溫度對納米粒粒徑的影響

Tab.1 The effect of temperature on nanoparticle size

溫度/℃粒徑/nm分散系數Zeta電位/mV20514±340.64±0.17-6.3±3.340304±190.35±0.16-7.8±4.66092±80.14±0.09-8.3±2.58089±60.13±0.03-6.4±3.4

蒸餾水用量對納米粒特性的影響見表2。當蒸餾水用量為8 mL時，制備的納米粒粒徑大且分布不均一。隨著制備納米粒蒸餾水用量的增加，其粒徑顯著減小。其中蒸餾水用量為32和64 mL所制備的納米粒無明顯差別，最終選擇蒸餾水用量為32 mL。

表2水相體積對納米粒粒徑的影響

Tab.2 The effect of volume of aqueous phase on nanoparticle size

蒸餾水/mL粒徑/nm分散系數Zeta電位/mV8853±1320.53±0.15-4.2±4.116213±320.45±0.19-6.1±2.23287±180.21±0.06-7.8±3.26493±130.15±0.09-6.4±2.8

當INH投入量為1，2和3 mg時，粒徑大小變化不大；但隨INH的投入量增加到4 mg，其粒徑明顯增大，因此選擇INH的投入量為2 mg。見表3。

2.3納米粒的表征 (1)粒徑及Zeta電位見圖 4。納米粒INH-DEX-OA的平均粒徑為89±3 nm，PDI為 0.12±0.03，Zeta 電位為-6.8 mV。

(2)外觀形態：由圖4C可知，在TEM下觀察，納米粒INH-DEX-OA呈球形，表面完整光滑，無明顯黏連現象，均勻度良好。

(3)載藥量及包封率：用HPLC法測定的納米粒INH-DEX-OA中INH載藥量為9.6%±0.9%，包封率為86.4%±0.8%。

表3投藥量對納米粒粒徑的影響

Tab.3 The effect of drug dosage on nanoparticle size

材料與DOX質量比/mg∶mg粒徑/nm分散系數Zeta電位/mV10∶184±30.31±0.17-6.7±2.310∶279±60.21±0.12-6.3±1.610∶389±40.22±0.09-7.6±1.910∶4312±160.24±0.08-8.9±2.2

圖4INH-DEX-OA的粒徑分布(A)、Zeta電位分布(B)和透射電鏡圖(C)

Fig.4 The size distribution (A)，Zeta potential distribution (B) and TEM image(C) of INH-DEX-OA

2.4納米粒體外釋藥 納米粒INH-DEX-OA的體外釋藥過程整體較為平穩，無明顯突釋現象。其中在突釋期納米粒INH-DEX-OA中的INH釋放度為17.2%，而最終平穩釋藥至50 h時，其累積釋藥度可達92.6%。見圖5。

圖5INH-DEX-OA在釋放介質中的累積釋藥曲線

Fig.5Invitrocumulative drug release profile of INH from INH-DEX-OA

2.5體外抗結核分枝桿菌活性 采用平皿二倍稀釋法測定目標化合物的體外抗結核分枝桿菌標準株(H37Rv)的活性，其游離INH和INH-DEX-OA的最小抑菌濃度(MIC)分別為0.252和<0.125 μg·mL-1。研究結果表明，納米粒INH-DEX-OA的體外抗結核分枝桿菌活性(MIC<0.125 μg·mL-1)優于游離INH(MIC=0.252 μg·mL-1)。

3 討論

藥物治療在臨床中發揮了至關重要的作用，但是藥物的毒性和不良反應影響治療，尤其是對結核病這種需長期服藥治療的疾病。隨著新型納米技術的快速發展，藥物制劑研究已進入遞藥系統時代，新材料、新技術的不斷涌現將逐漸實現藥物的靶向、定時、定位遞送[16-17]。納米遞藥系統因其具有良好的靶向性、優良的控釋性以及更好的安全性而備受關注。

丁小力等[18]通過自乳化二元溶劑擴散法制備了載異煙肼和利福平納米粒，該納米粒表面完整光滑、粒徑小、載藥量高，體外釋藥結果顯示，納米粒的體外釋藥過程較平穩，提示該納米遞藥系統具有一定的研究價值。通過自乳化二元溶劑擴散法制備納米粒工藝繁瑣且混有有機溶劑，這樣不僅增加了納米粒不均一的概率，同時對有機溶劑的有效去除也存在一定問題。此外該納米粒藥物包封率極低，是對原料藥物的極大浪費。在本研究中，我們通過酰胺鍵連接合成制備了兩親性共聚物材料DEX-OA，并通過透析法將其制備為載藥納米粒。同時，實驗研究了溫度、透析水量及藥物投量對納米粒的影響。研究顯示，制備溫度升高可使納米粒粒徑變小且分布更均一。Rittschof D等[19]的研究結果同樣顯示，膠束粒徑會隨溫度上升而變小。蒸餾水的用量影響納米粒的形成，當溶液中材料濃度較高，不利于分子間深入水中，易產生聚集體沉淀。藥物投量增加，納米粒粒徑增大，可能由于INH難溶于水，從而在納米粒表面吸附[20]。經過優化處方后制備的納米粒呈球形、粒徑小、載藥量及包封率高，且無有機溶劑殘留。實驗考察了納米粒INH-DEX-OA的體外釋藥情況，顯示納米粒INH-DEX-OA釋藥平穩，無明顯突釋現象，結果提示，納米粒INH-DEX-OA對INH的體外緩釋作用顯著。此外，體外抗結核活性實驗結果表明，INH-DEX-OA具有更強的抗結核桿菌活性。

本研究通過合成兩親性共聚物，并通過處方優化制得了粒徑小、載藥量高、釋藥性能平穩和抗結核活性較強的納米粒INH-DEX-OA，為其進一步體內抗結核活性研究奠定基礎。