HPLC法測定人血漿中的氫氯噻嗪及其在藥代動力學研究中的應用

張國蘭，馬瑞娟，閔云燕

(鄭州大學附屬兒童醫院，河南省兒童醫院，鄭州兒童醫院，鄭州 450018)

氫氯噻嗪(6-氯-3，4-二氫-2H-1，2，4-苯并噻二嗪-7-磺酰胺-1，1-二氧化物，HCT)為噻嗪類利尿藥，具有利尿、降壓作用，屬于苯并噻唑類化合物，是一種無臭無味的白色結晶粉末，微溶于水，溶于甲醇。它通過減少腎小管中電解質的再吸收，造成鈉離子和氯離子排泄的增加，從而導致水的排泄增加。氫氯噻嗪能增加鎂離子、鉀離子排泄，減少鈣離子排泄。

已有文獻報道采用HPLC法[1-6]、高效液相色譜-質譜/質譜聯用法[7-16]和毛細管電泳法[17-19]等不同檢測技術的方法用于測定復方降壓藥中氫氯噻嗪的含量以及單獨服用氫氯噻嗪或與其他藥物、生物液體合用時的質量濃度。然而這些檢測方法需要復雜的儀器設備、靈敏度較低、耗時較長，因此開發一種簡便快速的氫氯噻嗪測定方法十分重要。

筆者建立了一種準確、靈敏的用于測定人血漿中氫氯噻嗪質量濃度的HPLC法，并對該方法進行了驗證。該方法也成功地應用于氫氯噻嗪片的中國人體內的藥代動力學研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀系統(美國安捷倫公司)，配備了G1379A在線真空脫氣機、G1311A四元輸液泵、G1316A柱溫箱、G1313A自動進樣器及G1315B二極管陣列檢測器。

1.2試藥 氫氯噻嗪(質量分數>98.0%，批號LOT50183243)，氟康唑(質量分數>98.0%，批號LOT3968F450)，均購于美國Sigma公司。乙腈(色譜純)、三氟乙酸(色譜純)、乙酸乙酯、正己烷和磷酸二氫鈉，均購于百靈威公司。超純水(電阻>18 mΩ)，用美國密理博公司的Milli-Q純化系統制備。

2 方法

2.1樣品的制備

2.1.1對照品和質控樣品 氫氯噻嗪儲備液(100.0 μg·mL-1)和氟康唑儲備液(IS，10.0 μg·mL-1)用甲醇稀釋制得。用于校準和質量控制的工作液用甲醇稀釋儲備液制得。所有配制好的溶液均保存于4 ℃的冰箱中。

氫氯噻嗪對照品系列溶液分別由人空白血漿加入適量的工作溶液制得，最終制得氫氯噻嗪對照品溶液的質量濃度分別為5，10，25，50，100，200，300和400 μg·mL-1。質控(QC)樣品使用同樣的方法進行制備，其質量濃度分別為10，80和320 μg·mL-1。

2.1.2血漿樣品制備 向10 mL的EP管中加入500 μL血漿樣本和50 μL的內標氟康唑溶液(300 ng·mL-1)，混合1 min，然后加入500 μL質量濃度為50 g·L-1的磷酸二氫鈉溶液，4 mL的乙酸乙酯和1 mL的正己烷。渦旋混合2 min后以13 000 r·min-1離心10 min，上層清液被分離收集并在37 ℃條件下用氮氣吹干。殘留物加入200 μL的流動相，渦旋混合3 min使其重新溶解，以13 000 r·min-1離心10 min，取20，40，60，80和100 μL等20 μL的整數倍進樣量進樣分析。

2.2色譜條件 色譜柱采用 AgilentZOR-BAX Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，帶有保護柱XDB-C18protection 色譜柱(12.5 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相使用乙腈∶1 mL·L-1三氟乙酸∶水=20∶40∶40；檢測波長：266 nm；流速：0.8 mL·min-1。

2.3方法驗證 通過分別測定空白血漿樣品和加入了氫氯噻嗪、內標氟康唑的血漿樣品來評估該方法的選擇性。校正曲線通過連續3 d分析加標校準樣品進行驗證。以血漿中待測物質量濃度為橫坐標(x)、待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標(y)，用加權最小二乘法(W=1/x2)進行回歸運算，求得回歸方程，氫氯噻嗪的線性范圍為5～400 ng·mL-1。選擇血漿中氫氯噻嗪的定量下限(LLOQ)作為校準曲線中使用的最低質量濃度。

2.3.1準確度和精密度 通過測定10，80和320 ng·mL-13個質量濃度水平質控樣品來評估方法的準確度和精密度。方法的精密度用RSD值表示，準確度用相對誤差(RE)表示。

測定血漿樣品中氫氯噻嗪的峰面積與樣品萃取前的峰面積，與萃取后添加氫氯噻嗪溶液的血漿樣品的峰面積進行比較，測定氫氯噻嗪在3個質控質量濃度水平(n=6)下的萃取回收率。以類似的方法測定內標氟康唑(300 ng·mL-1)的萃取回收率。

2.3.2方法穩定性 在不同條件下，重復5次分析3種質量濃度(10，80和320 ng·mL-1)水平的血漿樣品來測試人血漿中氫氯噻嗪的穩定性。分別測定在室溫下存放4 h的加標樣品、在4 ℃條件下在自動進樣器中放置了24 h準備測定的萃取后的樣品，確定該方法的短期穩定性。測定連續3 d 在-20 ℃條件下3次完全凍融循環后的樣品，評估凍融穩定性。測定在-20 ℃條件下儲存28 d后的加標血漿樣品，評估該測定方法的長期穩定性。

2.4藥代動力學研究 實驗方案在本研究工作開展前得到了鄭州兒童醫院醫學倫理委員會的審查批準(批件號ICE-C-004-A06-V1.0)。按照赫爾辛基宣言的原則，選取20名男性健康志愿者，平均年齡26.5±3.1歲，體質量66.2±5.8 kg，志愿者均簽署知情同意書，同意參加該臨床研究。在研究工作開展前對提交了參與本項目協議的志愿者進行了血常規、尿常規、心電圖、肝腎功能、血壓和血糖等項目的檢查，志愿者各項檢查指標均正常。志愿者在開始測試的前7 d內未服用其他任何藥物，同時要求志愿者在研究工作開始前24 h禁煙禁酒，直到實驗結束。所有志愿者都用200 mL的水口服了劑量50 mg的氫氯噻嗪片。分別在口服給藥后的0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，12，24和36 h經肘靜脈采集血樣(3 mL)到預先添加了抗凝劑(肝素)試管中，將血液樣品以6 000 r·min-1離心10 min，分離血漿并在-20 ℃下冷凍，備用。

3 結果與討論

3.1方法的開發 為了獲得更好的色譜峰形狀，在可接受的保留時間和分辨率前提下，嘗試了幾種不同的溶劑配比優化流動相的組分。結果表明，目標化合物在乙腈∶1 mL·L-1三氟乙酸∶水(20∶40∶40)的流動相配比條件下，在很短的時間內就夠獲得良好分離效果[20]。在內標物的選擇中，優先使用氟康唑，沒有采用伊曲康唑和酮康唑，是因為在同樣的色譜條件下，使用氟康唑作為內標可縮短整個分析過程的時間，在實驗中的洗脫條件下，氫氯噻嗪和內標氟康唑的色譜峰均能被很好的分離，且沒有其他內源物質的干擾。

3.2靈敏度 在上述實驗條件下，氫氯噻嗪和內標氟康唑與其他內源性物質均有良好的分離效果。空白血漿樣品、加入氫氯噻嗪和內標氟康唑的血漿樣品以及志愿者血漿樣品的代表性色譜圖見圖1。在6個隨機選擇的人血漿樣品的色譜圖中，氫氯噻嗪和內標氟康唑的保留時間分別為4.2和5.5 min，且都沒有其他物質的干擾色譜峰出現，每個樣品的總運行時間為6.0 min。

圖1HPLC圖

A.空白血漿樣品；B.加入氫氯噻嗪(100 ng·mL-1)和氟康唑(300 ng·mL-1)的血漿樣品；C.志愿者血漿樣品；1.氫氯噻嗪；2.氟康唑。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.blank plasma sample；B.blank plasma sample spiked with HCT (100 ng·mL-1) and fluconazole(300 ng·mL-1)；C.plasma sample of the volunteers；1.hydrochlorothiazide；2.fluconazole.

3.3校準曲線的線性 在血漿中的氫氯噻嗪5～400 ng·mL-1的范圍內進行了峰面積比值與質量濃度的線性回歸擬合。校準曲線的回歸方程：y=414.894 8x-0.842 3，r=0.999 9，其中y表示氫氯噻嗪與內標氟康唑峰面積的比值，x表示血藥質量濃度。用于血漿中氫氯噻嗪測定的定量下限(LLOQ)為5 ng·mL-1。定量下限的精密度和準確度分別為8.5%和9.1%。

3.4精密度和準確度 用3個質量濃度水平(10，80和320 ng·mL-1)計算3 d的質控樣品的RSD值，評估該方法的精密度。質控樣品3個質量濃度的氫氯噻嗪的日內RSD值在7.7%以下，日間RSD值在8.9%以下。氫氯噻嗪在質控樣品3個質量濃度的相對誤差范圍為-7.1%～7.9%，結果表明，該方法的精密度和準確度均在可接受范圍內。

3.5回收率 在10，80和320 ng·mL-1的低、中、高3個質量濃度下，氫氯噻嗪的平均回收率分別為85.8%±5.4%，80.6%±5.0%和84.1%±4.4%(n=6)。內標氟康唑的回收率為82.7%±4.3%，見表1。

表1萃取后人血漿中氫氯噻嗪和氟康唑的回收率

Tab.1 Recovery rate test of HCT and fluconazole from human plasma after extraction

(n=6)

3.6穩定性 在室溫條件下，加入氫氯噻嗪的3個質控血漿樣品(10，80和320 ng·mL-1)，在3個凍融循環期的RSD值范圍為5.1%～8.6%，相對誤差范圍為-5.8%～8.4%，表現出良好的穩定性；在-20 ℃下儲存28 d的RSD值范圍為4.9%～7.2%，相對誤差范圍為-7.1%～-5.0%，也同樣表現出良好的穩定性；我們對萃取后在4 ℃條件下儲存至少24 h的樣品進行了測定，該方法均表現出良好的穩定性。

3.7該方法的實際應用 上述測定方法已通過了鄭州兒童醫院醫學倫理委員會倫理批準，成功應用于測定人血漿中氫氯噻嗪的質量濃度。在20名志愿者口服50 mg 氫氯噻嗪片后，對氫氯噻嗪的主要藥代動力學參數進行了計算評估。氫氯噻嗪的平均血藥質量濃度-時間曲線見圖2，主要藥代動力學參數計算結果見表2。

圖220名志愿者單次口服50mg氫氯噻嗪后的平均血藥質量濃度-時間曲線

Fig.2 Mean plasma concentration-time profiles of hydrochlorothiazide after a single oral administration of 50 mg HCT to 20 Chinese healthy male volunteers

表2氫氯噻嗪的主要藥代動力學參數計算結果

Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of hydrochlorothiazide

參數數值半衰期 t1/2/h11.70±1.60最大血藥質量濃度Cmax/ng·mL-1275.33±38.30達峰時間tmax/h2.25±0.34藥時曲線下面積AUC0→36/ng·mL-1·h2 295.75±219.15藥時曲線下面積 AUC0→∞/ng·mL-1·h2 546.99±229.78

4 結論

本研究前期通過反復實驗篩選，建立并驗證了一種以氟康唑為內標的血漿中氫氯噻嗪質量濃度的HPLC法，氫氯噻嗪質量濃度在5～400 ng·mL-1范圍內線性關系良好。氫氯噻嗪和內標氟康唑在單一洗脫模式下可獲得很好的色譜分離效果，且在各自的色譜峰位置無其他內源性物質的干擾，在7 min內可完成一次完整的分析。該方法選擇性好、靈敏度高，操作簡單、快速，適用于臨床口服氫氯噻嗪的藥代動力學研究。