microRNA-21對急性心肌梗死早期診斷及短期預后判斷的價值

郝謙 吳慧琴 楊捍衛

(中國人民解放軍武漢總醫院，湖北 武漢 430070)

急性心肌梗死(AMI)是冠心病中最常見且最致命的病癥。在急診科，對于AMI的早期診斷及恰當的救治方式是快速恢復心臟血流量以限制心肌壞死程度的重要因素，這在很大程度上影響患者的預后，降低患者并發癥發生率[1]。微小RNA(microRNA，miR)是20～22個核苷酸組成的小的單鏈非編碼RNA。能夠通過抑制靶信使RNA的翻譯或誘導其降解來下調蛋白質編碼基因的表達[2]。一些miR可作為心臟功能衰老退化的標志基因，也可能是AMI的新型的生物標志物[3-4]。Zhang等[5]研究發現，AMI患者血漿miR-21水平顯著升高，可能是AMI診斷的新型生物標志物。目前有關miR-21在AMI早期診斷及短期預后判斷的價值尚不清楚。本研究比較了AMI患者常規用于臨床診斷的cTnT與miR-21水平在AMI發病過程中的動態變化，并探討miR-21對AMI早期診斷及預后判斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年4月～2016年6月因急性胸痛發作6h內急診入院，且明確診斷為AMI的患者62例，其中急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)42例，急性非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)20例。納入標準：①有胸痛癥狀，發病在6h內。②心電圖、心肌標志物或心肌酶譜等指標符合2007年ACC/AHA制定的心肌梗死標準[6]。③冠脈造影檢查顯示有1支以上的冠脈血管狹窄超過50%。④經醫院倫理委員會批準，患者自愿參加，簽署知情同意書。排除標準：①因急性創傷引起的胸痛。②肺栓塞、主動脈夾層等引起的胸痛。③合并有肝腎功能不全、心臟瓣膜病、急性感染、血液系統疾病、惡性腫瘤等。另選取同期在本院體檢中心體檢健康者30例作為對照組。

1.2 方法 62例AMI患者分別于入院6h內、12h、24h、7d、14d采集靜脈血；30例健康對照組在清晨空腹采集靜脈血，3000r/min，離心10min，采集上清，置于無RNA酶的EP管中，-80℃冰箱保存。①cTnT檢測：cTnT采用全自動電化學發光免疫分析儀(Elecsys 2010，Roche公司)進行測定。cTnT>0.1ng/mL為陽性，cTnT>0.5ng/mL為AMI診斷參考值。②miR-21檢測：a.RNA抽提：按照mirVana PARIS試劑盒說明書(Ambion公司，美國)分離總RNA。使用NanoDrop ND-1000核酸定量檢測儀檢測RNA濃度和純度(NanoDrop公司，美國)。b.qRT-PCR：按照TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒說明書(Ambion公司，美國)進行逆轉錄，定量檢測血漿樣品中microRNA。qPCR在7300實時PCR系統(美國應用生物系統公司)上進行。使用2-ΔΔCT方法計算相對表達水平，使用U6作為miR-21表達的內部對照。通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血漿miR-21相對表達水平。

1.3 臨床隨訪 通過門診復診、電話進行定期隨訪，隨訪6個月，隨訪間隔1個月，觀察患者隨訪期間主要心血管不良事件(MACE)包括心源性死亡和再發心肌梗死的發生情況。

1.4 統計學分析 采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，正態分布的計量資料以(x±s)表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；計數資料采用卡方檢驗，兩指標之間的相關性采用Spearman相關分析；利用ROC曲線評價miR-21診斷AMI的能力。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料的比較 兩組受試者在年齡、性別、血脂等基線特征比較，差異無統計學意義(P>0.05)。AMI組患者入院6h內cTnT水平明顯高于對照組(P<0.01)，見表1。

2.2 兩組血漿miR-21相對表達水平比較 與正常對照組比較，入院6h內血漿miR-21相對表達水平在AMI組患者中明顯增高(t=10.096，P=0.000)，見圖1。

2.3 血漿miR-21、cTnT在AMI發病過程中的變化 miR-21在入院6h內開始增高，12h達到高峰，24h、7d、14d逐漸下降至接近正常。cTnT在入院6h內開始增高，12h逐漸升高，24h達到高峰，7d、14d逐漸下降至接近正常，見圖2、3。

2.4 相關性分析 經Spearman相關性分析結果顯示，發病初血漿miR-21、cTnT水平呈正相關(r=0.667，P=0.000)，見圖4。

2.5 血漿miR-21、cTnT對AMI的診斷價值 應用ROC曲線分析血漿miR-21、cTnT早期診斷AMI的價值，入院6h以內血漿miR-21的ROC曲線下面積(AUC)為0.939(95%CI：0.893～0.984，P=0.000)，當miR-21值>3.9時，敏感度為83.9%，特異度為86.7%，陽性預測值為92.9%，陰性預測值為72.2%；入院12h時miR-21的AUC為0.956(95%CI：0.918～0.994，P=0.000)，當miR-21值>4.8時，敏感度為83.9%，特異度為90.0%，陽性預測值為94.5%，陰性預測值為73.0%；入院6h以內cTnT的AUC為0.964(95%CI：0.932～0.996，P=0.000)，當cTnT值>0.18時，敏感度為90.3%，特異度為90.0%，陽性預測值為94.9%，陰性預測值為81.8%；入院12h時cTnT的AUC為0.979(95%CI：0.956～1.000，P=0.000)，當cTnT值>0.20時，敏感度為90.3%，特異度為93.3%，陽性預測值為96.6%，陰性預測值為82.4%，見圖5。

表1 兩組受試者臨床資料的比較Table 1 Comparison of clinical data in each group

2.6 隨訪分析 62例AMI患者隨訪6個月，有9例患者發生MACE，其中心源性猝死2例，7例再次發生AMI；在入院6h內、12h、24h、7d、14d時間段，發生MACE的患者血漿miR-21相對表達水平與未發生MACE的患者比較，差異均有統計學意義(均P<0.01)，見圖6。

圖1 入院6h以內兩組miR-21相對表達水平的比較

Figure1ComparisonofrelativeexpressionlevelsofmiR-21betweenthetwogroupswithin6hadmission

3 討論

研究表明，miR-21參與了心肌梗死的發病過程。管文娟等[7]研究發現，冠心病患者外周血miR-21高表達，AMI組血漿miR-21表達水平顯著高于心絞痛組，且與冠脈病變的嚴重程度具有正相關性。Zhang等[8]研究發現，AMI患者血漿miR-21水平顯著升高。

圖2 血漿miR-21水平在AMI發病過程中的變化

Figure2ChangesofplasmamiR-21levelsduringthecourseofAMI

圖3 cTnT水平在AMI發病過程中的變化Figure 3 cTnT levels in the pathogenesis of AMI

圖4 血漿miR-21與cTnT水平的相關性分析

Figure4CorrelationAnalysisofPlasmamiR-21andcTnTLevels

圖5 血漿miR-21和cTnT水平對AMI早期診斷的ROC曲線分析

Fig.5ROCcurveanalysisofplasmamiR-21andcTnTlevelsforearlydiagnosisofAMI

圖6 miR-21在發生MACE和未發生MACE患者的波動圖

Figure6FluctuationofmiR-21inpatientswithandwithoutMACE

與CK，CK-MB和cTnI相比，miR-21具有相似的診斷AMI能力，可能是AMI診斷的新型生物標志物。本研究旨在通過檢測AMI患者血漿miR-21的相對表達水平，探討其作為AMI早期診斷標志物的潛在價值。結果顯示，AMI患者血漿miR-21水平較對照組明顯增高，miR-21在入院6h內開始增高，12h達到高峰，24h、7d、14d逐漸下降至接近正常。cTnT在入院6h內開始增高，12h逐漸升高，24h達到高峰，7d、14d逐漸下降至接近正常。miR-21與經典AMI診斷指標cTnT相比，增高更早達到峰值。此外，miR-21與cTnT呈顯著正相關。進一步采用ROC曲線分析對miR-21對AMI的早期診斷價值，結果顯示，入院6h內、12h血漿miR-21的 AUC分別為0.939和0.956，入院6h內、12h血漿cTnT的AUC分別為0.964和0.979。根據Swets的診斷標準，當AUC在0.7～0.9之間時，ROC曲線更準確，AUC>0.9表示高準確率。miR-21與cTnT對AMI的診斷均有較高的敏感度和特異度，對于AMI具有可靠的診斷價值，但miR-21的診斷價值并不優于cTnT。

已有研究表明，miR-21在多種心血管疾病中起到重要的作用[9]。miR-21參與心房纖維化和心房顫動(AF)的發生，成纖維細胞富集miR-21，這有助于心血管系統的纖維化和心力衰竭的發展。其機制可能是miR-21通過上調WWP-1使TGF-β1/Smad2信號通路失活來抑制心臟成纖維細胞的增殖，是心房纖維性顫動中心房纖維化機制的新的見解[10-11]。研究證實，在梗死邊緣和梗死區域的早期階段(6h)中有多種miRNA異常表達[12]。Darabi等[13]研究發現，ACS患者血清miR-21水平顯著高于穩定型冠狀動脈疾病患者，miR-21增高可能通過促進炎癥反應來參與ACS的發病機制。而抑制miR-21表達可通過M2巨噬細胞的抗炎作用來減少支架再狹窄[14]。miR-21參與了冠脈動脈粥樣硬化過程，與調控炎性因子、促進炎癥反應來影響斑塊穩定性有關，miR-21增高導致冠心病患者心血管事件發生風險增高。本研究中62例AMI患者隨訪6個月，有9例發生MACE，在AMI發病過程中，不同時間點發生MACE的患者血漿miR-21相對表達水平均明顯高于未發生MACE的患者，提示miR-21水平增高預示發生MACE的風險增高。miR-21對于AMI患者預后評估具有一定的參考價值。

血漿miR-21顯示出一些診斷心血管疾病的潛力。然而，由于microRNA在生物系統中的復雜性，除了ACS患者具有不同遺傳、社會和治療特征之外，其他因素如納入對象的選擇，樣本量大小也會對研究結果造成一定的影響[15]。本研究也存在一些不足之處：①患者樣本量偏小且為單中心研究，以及未納入心絞痛患者也都有可能影響研究結果；②研究發現，cTnT可以在1年內預測心肌梗死復發和死亡風險[16]。本研究隨訪時間較短，miR-21對發生MACE的近期和遠期預后判斷缺乏更有力的數據支持，這有待于后面的工作進一步隨訪觀察分析。③雖然已有研究表明，miR-21在早期診斷AMI具有一定的臨床價值，但相關的臨床研究極少，miR-21檢測和臨床應用中的各種問題仍有待于進一步解決，包括如何快速檢測出結果，縮短檢測時間，臨界診斷值的界定，以及miR-21水平在風險分層、與冠脈病變嚴重程度之間的關系、預后評估等問題需要進一步研究。

4 結論

本文資料顯示，血漿miR-21相對表達水平在AMI患者中有明顯增高，可能成為早期診斷AMI潛在的新型生物標志物。故miR-21水平對AMI的早期診斷和預后評估具有一定的臨床參考價值，但并不優于cTnT檢測價值。