基于酒曲中產(chǎn)凝乳酶微生物菌株的分離篩選及鑒定分析

◎ 唐賢華

（四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830）

酒曲本身含有微生物，此類微生物源自代謝與發(fā)酵的產(chǎn)物。通過篩選能夠獲得優(yōu)良的霉菌原料，從而提煉出優(yōu)質(zhì)的凝乳酶。在細(xì)菌的輔助下，對微生物菌株有必要妥善予以篩選，同時(shí)還要妥善分離并且施行綜合性的菌株鑒定處理。因此，在目前實(shí)踐中，關(guān)于上述的酒曲分離與篩選技術(shù)應(yīng)當(dāng)側(cè)重保障最根本的菌株安全，在此前提下完成精確的菌株鑒定操作。

1 微生物菌株的篩選與分離

1.1 菌株篩選

在初次篩選菌株時(shí)，針對發(fā)酵酒曲可以借助純化與分離的方式來獲得純凈度較高的菌落形態(tài)。在此前提下，確保將酪蛋白平板連接于各個(gè)菌株的相應(yīng)位置上，然后將其置于恒溫培養(yǎng)箱并且完成2 d左右的菌株培養(yǎng)。通過全方位的菌株測定與菌株觀察，可以測出其中的水解圈與凝乳圈直徑大小[1]。

具體在篩選不同菌株時(shí)，如果測定的水解圈直徑為零，則意味著此類菌株并不會生成相應(yīng)的凝乳酶成分。反之，如果菌株本身表現(xiàn)為較大的白色凝乳圈，則意味著此類菌株具備較高的凝乳活力。從干酪風(fēng)味的角度講，經(jīng)過水解處理以后的菌株活力很可能影響特殊的干酪風(fēng)味。可見，在篩選多種菌株時(shí)，最好選擇較低水解活力并且富含較多蛋白成分的微生物菌株。

1.2 菌株分離

對于不同特性的微生物菌株有必要妥善予以分離，然后分別測定相應(yīng)的凝乳酶比例。在初次篩選的基礎(chǔ)上，運(yùn)用酪蛋白法可以選出其中具備獨(dú)特優(yōu)勢的微生物菌株，并且將上述菌株放置于酪蛋白的平板范圍內(nèi)進(jìn)行分離。經(jīng)過菌株的全面分離操作以后，還需經(jīng)過一天的菌株培養(yǎng)，而后才能生成活化種子液。在不同的培養(yǎng)基內(nèi)，至少需要完成1 d的菌株培養(yǎng)操作，確保其符合120 r/min的搖床振蕩頻率以及30 ℃的菌株培養(yǎng)溫度[2]。

通過觀察各類菌株，可知在4 h以內(nèi)的時(shí)間段內(nèi)，微生物菌株的生長速度相對緩慢，而與之相應(yīng)的生物量也會基本維持恒定。到了12 h的時(shí)候，多數(shù)微生物菌株都能達(dá)到最快的菌株生長速度，其中某些菌株呈現(xiàn)幾何級的菌類細(xì)胞增長趨向。在此之后，凝乳酶將會緩慢降低凝乳酶活性，直至與蛋白水解的活性大體相同。

2 具體的菌株鑒定技術(shù)

對于分離以后的微生物菌株來講，應(yīng)當(dāng)將其置于固體平板的相應(yīng)位置上。經(jīng)過兩天的菌株劃線培養(yǎng)以后，觀察可見菌落整體上呈現(xiàn)淡黃色或者乳白色，其中粗糙表層上帶有不透明的黏液，并且呈現(xiàn)不整齊的菌落邊緣狀態(tài)。通過運(yùn)用穿刺試驗(yàn)的方式，可以測出其中含有芽孢菌類與革蘭氏菌類。具體而言，LB類型的菌株呈現(xiàn)短桿的形態(tài)，經(jīng)過檢測可得陽性的革蘭氏反應(yīng)結(jié)果。與此同時(shí)，此類菌株還呈現(xiàn)顯著的運(yùn)動(dòng)性，菌株中間生長芽孢。

在測定蛋白具備的水解活性時(shí)，應(yīng)當(dāng)將酪蛋白溶液（1.5%，2 mL）置于35 ℃條件下5 min，然后在現(xiàn)有的溶液內(nèi)部增添酶溶液（0.5 mL）。經(jīng)過1 h的恒溫水浴處理以后，確保將上述溶液予以均勻混合。對于上述的測試過程，如果要終止整個(gè)測試反應(yīng)，則需加入三氯乙酸（8%濃度，2 mL）。在確保溶液已經(jīng)完全沉淀以后，就可以制作成待測的空白樣本。對產(chǎn)凝乳酶的菌類進(jìn)行測定時(shí)，最好選擇LB平板。經(jīng)過恒溫培養(yǎng)以后，觀察可知革蘭氏菌或者芽孢染色體的菌類形態(tài)，從而整體掌握菌類的基本形狀，以便于妥善分離選擇。

此外，關(guān)于鑒定菌株，還可選擇PCR擴(kuò)增的新型鑒定技術(shù)。具體在實(shí)踐中，通過運(yùn)用瓊脂凝膠電泳以及產(chǎn)物擴(kuò)增的方式，觀察可看到有特異性的條帶產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用純化回收酒曲產(chǎn)物的方式再次測定其中的菌株序列長度，可得大約1 400 bp左右的序列長度[3]。對于GSBa的凝乳酶種類而言，觀察可知此類菌株呈現(xiàn)棉絮的蓬松狀，并且外表呈現(xiàn)淺灰色。相較于其他種類的凝乳酶，此類凝乳酶菌株呈現(xiàn)相對較長的凝乳反應(yīng)時(shí)間。序列擴(kuò)增獲得的菌株鑒定結(jié)果，如圖1所示。

圖1 序列擴(kuò)增獲得的菌株鑒定結(jié)果圖

3 結(jié)語

對于酒曲予以篩選并且分離處理，可以獲得凝乳酶的多種微生物菌株，其中典型的為淀粉芽孢桿菌。對于微生物菌株，選擇上述措施予以制備有明顯的優(yōu)勢，便于進(jìn)行相應(yīng)的成分鑒定。因此，在當(dāng)前實(shí)踐中，關(guān)于酒曲中含有的微生物凝乳酶菌株還需著眼于全面加以探究，運(yùn)用菌株鑒定、菌株分離與篩選等措施來確保菌株篩選的實(shí)效性。