大豆過氧化物酶的提取與分離純化研究

劉 力

(武漢華測檢測技術有限公司食品實驗室，湖北 武漢 430223)

1 引言

大豆過氧化物酶(POD)是從豆殼或大豆胚芽中提取的一種活性很高的過氧化物酶，是由單一肽鏈和卟琳構成的血紅素蛋白，脫輔基蛋白分子需與血紅素結合能構成全酶[1]。分子量為37000D，300多個氨基酸殘基組成，等電點為3.9，是酸性蛋白質[2]。大豆POD酶由兩個結構域組成，中間是血紅素輔基，Kamal[3]等推出由77%的α-螺旋、16%的β-折疊和β-轉角及其它結構組成其結構域。大豆過氧化物酶和辣根過氧化物酶的結構及作用機理有許多相似之處，都屬于植物過氧化物酶超家族的Ⅲ類酶[4]。它們具有相似的三維折疊模式，氨基酸序列有57%的同源性，兩者都含有1個色氨酸，2個Ca2+，4個二硫鍵和8個多糖?，F在，對辣根過氧化物酶的研究較成熟，大豆過氧化物酶的研究甚少。

目前，國內對大豆過氧化物酶的研究還局限在提取分離方面，對酶的固定化和應用方面研究甚少。而國外的研究已經深入到酶的基因改造和分子修飾方面，對應用方面的研究也較多，主要在工業“三廢”處理方面[14]。

2 材料與方法

2.1 實驗材料與試劑

大豆(市售) 武漢市農產品大市場；愈創木酚溶液(分析純) 天津市凱通化學試劑有限公司；BSA牛血清白蛋白(分析純) 天津市凱通化學試劑有限公司；殼聚糖(分析純) 天津市凱通化學試劑有限公司，其他試劑無特殊說明均為分析純。

2.2 實驗儀器

垂直平板電泳槽：上海亞榮生化儀器廠；熱水合反應釜：上海青蒲滬西儀器廠；722E型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；756P型紫外可見分光光度計(配有sp756P紫外光譜工作站)， 上海光譜儀器有限公司；KQ3200E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

3 實驗方法

3.1 分析方法

3.1.1 酶活性的測定

本試驗采用愈創木酚法測定過氧化物酶的活性。其原理是在有雙氧水存在的條件下，以愈創木酚為底物，加入過氧化物酶后會將愈創木酚氧化成一種茶褐色物質，該物質在470 nrn處有最大吸收，通過測定茶褐色物質生成的量可以確定酶的活性，具體反應方程式如圖1。

圖1 愈創木酚法測酶活反應原理

酶的活力用酶的活力單位(Units)來表示。酶的活力單位是以每分鐘轉化1 μmol底物定義為1個活力單位。

在測定酶的活力前需要配制反應混合液。配制反應混合液需加入愈創木酚與3%過氧化氫(v/v=1∶1)3 mL，在加入50 μL酶液啟動反應，用反應混合液不加酶作為空白對照，混合后搖勻，立即計時，在470 nm處測其吸光度值，讀取第一個吸光值，60 s后讀取第二個吸光值，有時反應速度比較快，或反應體系變化比較快，就采用每20 s讀一次。按照下式計算酶的活性。

酶活力(U/mL)=

若要計算總酶活力只要再乘以酶液總體積就可以得到。

3.1.2 酶比活力的測定

酶的比活力(Units/mg)是指酶的活力值與酶蛋白含量(mg)的比值。酶的比活力可以用來表示酶的純度。對于同一種酶比活力值越高其純度越高。本試驗采用考馬斯亮藍法測定酶的蛋白含量。

測定蛋白質還需繪制標準曲線，以牛血清蛋白為標準品來測定。將牛血清蛋白配制成0.1 mg/mL的標準溶液，分別用移液管移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL并置于6支試管中,然后向試管中依次加入1.0 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0.0 mL的蒸餾水，搖勻。后向每支試管中加入配制好的考馬斯亮藍G-250溶液5.0 mL，搖勻，靜置15 min。第一個試管中空白溶液作為對照，在595 nm處測定其吸光度值，以蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，做出標準曲線。

取1 mL的待測酶液，加入5.0 mL考馬斯亮藍溶液后搖勻，靜置15 min，在595 nm處測其吸光度值，根據標準曲線求得蛋白質的濃度，然后計算出蛋白的含量，最后求得酶的比活力。

3.1.4 酶Rz值的測定

酶的純度可以用Rz值來表示，Rz值越高，酶純度越高。通常Rz值達到2左右即表示高純度酶。

Rz的計算公式：

式中：A403為血紅素輔基的吸收值，A275為蛋白質的吸收值。

3.1.4 酶的結合效率

酶結合效率又稱酶的固定化率，是指酶與載體結合的百分率，酶結合效率的計算一般由用于固定化的總酶活力減去未結合的酶活力所得的差值，在除以用于固定化的總酶活力得到：

未結合的酶活力，包括固定化后濾出固定化酶后的濾液以及洗滌固定化酶的洗滌液中所含的酶活力的總和。

充分混勻。分別移取上述苯酚標準溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于試管中，補水至10.00 mL，搖勻后，在最大吸收波長λ的條件下，以水為空白對照測其吸光度。以苯酚標準溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。

3.2 過氧化物酶的提取、分離與純化

3.2.1 過氧化物酶的提取

3.2.1.1 預處理

將市售黃豆按1∶1(v/v)的比例加蒸餾水，浸泡4～6h待黃豆充分溶脹后剝下大豆胚芽與種皮，瀝干水分。將大豆胚芽4℃下冰箱保存，豆殼置于自然條件下風干或50 ℃烘箱下烘干，粉碎，過50目篩，得豆殼干粉。

3.2.1.2 提取流程

準確稱取大豆胚芽10.00 g加入200 mL 4 ℃的0.2 M PBS緩沖液(pH=6.0)，組織勻漿，超聲功率為750 W，時間為41 min，提取溫度為15 ℃，于4 ℃下8000 r/min離心15 min，收集上清液得酶粗提液A。

準確稱取豆殼10.00 g加入200 mL的0.2 M PBS緩沖液(pH=6.0)，超聲功率為750 W，時間為41 min，提取溫度為15 ℃，于4 ℃下8000 rpm離心15 min，收集上清液得酶粗提液B。

3.2.1.3 大豆不同部位POD酶含量比較

取上述兩種不同部位提取的酶粗提液A、B，測定其酶活力、比活力、蛋白質濃度與Rz值。

3.2.2 過氧化物酶的分離與純化

3.2.2.1 硫酸銨沉淀

在不斷攪拌下每升上清液中慢慢加入240 g硫酸銨粉末(0.3～0.4飽和度)，在1～2 h內加完后置冰箱中過夜，次日將上清液用虹吸管移出，下面混濁液用3000 r/min離心15 min，棄沉淀合并上清液，按每升上清液加256 g硫酸銨粉末(0.8飽和度)邊加邊攪拌，大約在1 h內加完，當硫酸銨全部溶解后置冰箱內于4 ℃下過夜，次日用虹吸管吸出上清液，沉淀部分用3000 r/min離心20 min，保留沉淀，懸浮于150 mL蒸餾水中，(使沉淀全部溶解為止)，分裝于透析袋(規格:分子量大于10000，下同)，內4 ℃透析48 h以后有沉淀析出，4000 r/min離心15 min，得上清液。測定其酶活力、比活力、蛋白質濃度與Rz值。

3.2.2.2 丙酮沉淀

將上清液倒入燒杯中冰浴，加入-15 ℃的丙酮，4000 r/min離心15 min，得上清液，再加入0.8倍體積的-15 ℃的丙酮，離心后收集沉淀并溶于少量蒸餾水中，透析除去丙酮。測定其酶活力、比活力、蛋白質濃度與Rz值。

3.2.2.3 硫酸鋅除雜

將沉淀稀釋，滴加1 mol/L的硫酸鋅溶液，離心后上清液透析除鹽。測定其酶活力、比活力、蛋白質濃度與Rz值。

3.3.3 酶絡合物電泳分析(SDS-PAGE)

將純化后的POD酶進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染色以確定POD酶的相對純度。

4 結果與討論

4.1 牛血清蛋蛋白質標準曲線的繪制

根據表的結果，繪制標準曲線如圖2所示。

由圖2可知，蛋白質含量測定的標準曲線方程為：y=0.0429x+0.0067，R2=0.9991，蛋白濃度在0 μg/mL～ 18 μg/mL的范圍內線性關系良好。

4.2 不同部位提取的過氧化物酶

4.2.1 對酶比活力與Rz值的影響

采用超聲輔助法提取大豆過氧化物酶，按照方法3.1.1檢測酶特征指標，其中，豆殼POD的蛋白含量為38.68 mg，酶的活力為4476.42 U/mL，酶的比活力約為115.73 U/mg，此時豆殼POD的Rz值為0.15；大豆胚芽POD的蛋白含量為25.18 mg，酶的活力為7609.92 U/mL，酶的比活力約為302.27 U/mg，此時大豆胚芽POD的Rz值為0.19。

圖2 牛血清白蛋白標準曲線

4.2.2 過氧化物酶含量比較

經超聲輔助法提取大豆不同部位過氧化物酶，并對其POD多種特性指標進行比較，結果如表1所示，豆殼中POD酶活力僅為大豆胚芽中POD酶的58%，而同比大豆胚芽中蛋白含量比豆殼中蛋白含量下降12 mg/mL左右。此時，大豆胚芽中POD酶的比活力是豆殼中POD酶的比活力的2.61倍。

表1 大豆不同部位過氧化物酶特性指標比較

分析原因，可能是由于豆殼暴露在外，其POD失活較為迅速，而大豆胚芽位于種皮內部POD酶活力高，且大豆胚芽生長活力旺盛蛋白含量較豆殼略低，因此，較豆殼而言大豆胚芽為過氧化物酶提取的最佳原料。

4.3 POD酶分離純化倍數的計算

純化過程中純化倍數如表2所示

表2 酶純化各步驟的參數計算

由表2可得，當僅用超聲波提取得到的大豆過氧化物酶，其酶活力U/mL為4476.42 U/mL，比活力為：115.73 U/mg,，蛋白質濃度為：36.68 mg/mL ，RZ值為：0.15，純化倍數為：1.00。而經過逐級純化，其值逐漸發生變化，最終隨著RZ值不斷提高，純化倍數也得到提高。

4.4 電泳分析結果

分別對大豆過氧化物酶、分子量標準樣品、抗體和酶結合物嚴物進行電泳分析，得到結果如圖3。

圖3 SDS-PAGE電泳圖

從圖3 SDS-PAGE電泳圖，可看出大豆POD酶在65～95 kb的地方出現明顯的條帶，可推斷出大豆POD酶分子量大約在65kb和95kb之間。由于酶本身和酶與酶的結合物存在于酶提取液中，且可溶于50%飽和度的硫酸銨及其丙酮，因此在進行硫酸銨沉淀與丙酮沉淀中而將其去除，且在進行硫酸鋅除雜的過程中，出去的是一些不溶于硫酸銨及其丙酮的雜蛋白。因此在反應產物電泳條帶中沒有出現雜條帶，只出現了硫酸鋅除雜后的條帶，將其與Marker進行比較，可推斷出分子質量，根據分子質量查相關書籍[16]，可得出該酶是過氧化物酶。

5 結論

采用超聲輔助法提取大豆不同部位的過氧化物酶，工藝條件為：超聲功率750 W，提取溫度15 ℃，提取時間41 min，同時對比豆殼與大豆胚芽中POD酶特性指標：豆殼中POD酶活力僅為大豆胚芽中POD酶的58%，而同比大豆胚芽中蛋白含量比豆殼中蛋白含量下降12 mg/mL左右。此時，大豆胚芽中POD酶的比活力是豆殼中POD酶的比活力的2.61倍。因此，較豆殼而言大豆胚芽為過氧化物酶提取的最佳原料。進一步對大豆過氧化物酶的分離純化方法，采用硫酸銨分級沉淀、丙酮分級沉淀和硫酸鋅除雜等方法，并對其提取工藝條件進行優化，結果如下：經硫酸銨沉淀、丙酮沉淀和硫酸鋅除雜后，大豆POD酶活力13765.00 U/mL，蛋白質濃度3.11 mg/mL，酶的比活力4432.52 U/mg，Rz值1.59，且純化倍數達38.30。同時，經SDS-PAGE電泳分析后，可推斷出該大豆POD酶的分子量大約在65～95 kb之間，且只出現了一個條帶，可看出純化效果較好。