綠豆發芽過程中SOD和蛋白質的變化規律研究

符麗雪 ， 錢麗麗 ，2

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江大慶 163319）

綠豆不僅包含人體所需的基本營養物質，還擁有許多生物活性物質，如黃酮類化合物、多酚類、多糖、蛋白質水解酶、苯丙氨酸氨解酶、抗性淀粉、香豆素、生物堿等[1]。這些成分都具有一定的生理功能，如改善腸道菌群組成、降血脂血糖、抗氧化、提高免疫力、清熱解毒等[2]。并且相關研究[3]表明，綠豆發芽時，伴隨酶活性的啟動，其活性成分及營養物質發生部分改變，從20世紀60年代初至今，人們積極從綠豆及其萌芽中找尋生物活性物質，并對其進行分離提純及定性定量的研究。目前對于綠豆中活性成分的研究主要集中在黃酮類化合物，國內對于雜糧中SOD性質的研究多數集中在水稻、玉米、大豆等作物中，但在綠豆作物中有關SOD的研究較少，試驗以綠豆為原料，研究綠豆在發芽3～7 d內的SOD活性變化規律，采用NBT光還原法[4]測定綠豆發芽不同時期及不同部位的SOD活性，參考考馬斯亮藍G-250法檢測蛋白質含量。對綠豆發芽時間、發芽部位SOD活性進行差異性顯著分析。

1 試驗材料和儀器

1.1 試驗材料

綠豆（市售）。

1.2 試驗儀器

FA2004B型電子天平，上海菁海儀器有限公司產品；DHP600型恒溫培養箱，上海鵬順科學儀器有限公司產品；2-16p型離心機，德國CGM產品;Intergral5型默克純水儀，默克化工技術有限公司產品；HYQ-212A型快速混勻器，深圳市瑞鑫達儀器有限公司產品；WisetisHG-15D型數碼分散機，廣州泰通儀器有限公司產品；澳柯瑪冰箱，澳柯瑪股份有限公司產品。

1.3 試驗主要試劑

核黃素，分析純，合肥博美生物科技有限責任公司提供；氯化硝基四氮唑藍（NBT），高純級，合肥博美生物科技有限責任公司提供；考馬斯亮藍R250，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司提供。

2 試驗方法

2.1 綠豆發芽工藝流程

稱取綠豆→挑選綠豆→純水清洗→恒溫浸泡→種子露白→移栽培養→綠豆芽。

2.2 操作要點

①稱取500 g的綠豆；②挑選綠豆，挑選顆粒飽滿、無蟲害及霉變的綠豆；③純水清洗，使用默克純水儀生產的超純水清洗綠豆表面；④每100 g綠豆中加入500 mL超純水，放在燒杯中浸泡24 h；⑤待種子露白后將綠豆取出放置在鋪有3層紗布的長方形瓷盤中繼續培養，使用小噴瓶每天澆水2次，澆水至浸沒紗布為止，在24℃恒溫培養箱中進行培養，并及時將不同天數的綠豆進行分離處理。

2.3 綠豆發芽過程中SOD和蛋白質的變化規律

采集發芽不同時間（3～7d）的綠豆及不同部位樣品作為研究對象，研究綠豆芽發芽過程中SOD和蛋白質的變化規律。

2.3.1 SOD的變化規律研究

取整根綠豆、根（胚根）、莖（下胚軸）、胚（胚芽）于50℃烘箱中烘24 h至干，將烘干后的樣品粉碎后，放入中號塑料袋或塑料瓶中備用；稱取綠豆芽樣品粉末5 g，加入磷酸緩沖液（PBS） 25 mL，攪拌均勻后，在4℃條件下，以轉速10 000 r/min離心20 min，取得的上清液為SOD酶粗提液。

SOD活性測定試劑見表1。

表1 SOD活性測定試劑

按表1加好試劑，在4 000 lx熒光燈下進行照光，時間控制在20 min，（主要目的是各管照光情況相同，把控反應溫度在25～35℃，反應時間根據酶活性高低而定)，最后于波長560 nm處測定各反應液的吸光度。以緩沖液替代酶液做空白對照。

2.3.2 蛋白質的變化規律研究

采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白含量。

2.4 試驗結果計算

以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD酶活性。

式中：ACK——照光對照管的吸光度；

AE——樣品管的吸光度；

V——樣液總體積，mL；

Q——樣品質量，g；

VT——測定時樣品的用量，mL；

2.5 數據處理方法

試驗數據處理采用SPSS 19.0版本的單因素方差分析方法，多重比較采用Duncan法。圖形處理為Microsoft Excel（Office 2007） 軟件。

3 結果與分析

3.1 不同發芽時間SOD酶及蛋白質含量的變化規律

以發芽時間在3～7 d內的整根綠豆為樣品進行酶活和蛋白質的測定。

綠豆發芽時間對SOD及蛋白含量的影響見表2。

表2 綠豆發芽時間對SOD及蛋白含量的影響

由表2可知，由于發芽時間不同，SOD活力和蛋白質含量均存在顯著性差異。SOD活力最高為3 079 U/mL，蛋白含量最高為4.49 mg/mL。隨著發芽時間的延長，酶活力不斷攀升，第3天到第5天的增幅達21.9%；在第5天達到頂峰，隨后開始緩慢降低，降幅相比增幅小；而第5天到第7天的降幅僅為8%；綠豆發芽3～7 d過程中，蛋白質含量不斷上升，綠豆通過葉的光合作用不斷合成新的蛋白質。依據綠豆發芽3～7 d的酶活力和蛋白含量，計算SOD比活力。綠豆發芽第5天時，比活力最大。發芽3～5 d的情況下，SOD的比活力存在顯著性差異。

3.2 研究不同部位SOD及蛋白質含量的變化規律

3.2.1 綠豆莖的酶活及蛋白含量測定

以發芽時間在3～7 d內的綠豆莖為樣品進行酶活和蛋白質的測定。

綠豆莖的酶活及蛋白含量見表3。

由表3可知，發芽3～5 d時，綠豆莖中SOD活力差異顯著，SOD活力最高為1 311 U/mL，蛋白含量最高為4.79 mg/mL；發芽時間在4～6 d時，SOD的比活力差異不顯著。

表3 綠豆莖的酶活及蛋白含量

3.2.2 綠豆胚的酶活及蛋白含量測定

以發芽時間在3～7 d內的綠豆胚為樣品進行酶活和蛋白質的測定。

綠豆胚的酶活及蛋白含量見表4。

表4 綠豆胚的酶活及蛋白含量

由表4可知，SOD活力最高為2 458 U/mL，蛋白含量最高為5.15 mg/mL。發芽3～5 d時，綠豆胚的SOD的比活力差異顯著，伴隨發芽時間的增長，SOD的比活力也逐漸增加，當發芽時間超過5 d后，SOD的比活力反而減小。

3.2.3 綠豆根的酶活及蛋白含量測定

以發芽時間在3～7 d內的綠豆根為樣品進行酶活和蛋白質的測定。

綠豆根的酶活及蛋白含量見表5。

由表5可知，SOD活力最高為5956 U/mL，蛋白含量最高為4.27 mg/mL，除發芽第5天SOD的比活力外，發芽3～7 d內的SOD的比活力差異不顯著。

綠豆中的SOD主要集中在綠豆的根部，綠豆不同部位隨發芽時間的變化與綠豆芽整體類似，均呈現先上升后下降的趨勢，綠豆生長過程中，SOD比活力大小的順序為根＞胚＞莖。綠豆根的活性最高，其SOD的比活力分別為胚、莖的3倍和5倍。

表5 綠豆根的酶活及蛋白含量

4 結論

以綠豆為原料，在發芽3～7 d的條件下，制備綠豆SOD粗酶液，研究SOD活性和蛋白質含量的變化規律。通過試驗發現，綠豆SOD比活力在發芽過程中呈鐘形曲線，比活力在發芽初期隨時間延長而增大，發芽至第5天時，SOD的比活力最強，為783 U/mg，隨后開始出現下降趨勢。綠豆發芽過程中不同部位間SOD比活力存在顯著性差異。綠豆發芽時根部SOD的比活力最強，為1 649 U/mg。蛋白質含量與發芽時間成正比，隨發芽時間的增長而增大。