酵母雙雜交技術篩選人95D細胞中肺癌轉移相關蛋白1相互作用蛋白及其驗證

李彥芹，劉 揚，梁麗玲，許 陽

在我國乃至全球，肺癌都具有高發病率和高死亡率的特點，研究與肺癌相關的基因對肺癌的診斷及治療有重要意義。肺癌轉移相關蛋白1(lung cancer metastasisrelated protein 1，LCMR1)基因是從人肺巨細胞癌細胞系中分離的與肺癌轉移明顯相關的基因[1]，GenBank 數據庫注冊號 (Gene ID：AY148462)。該基因全長949 bp，分子量約19 kD，編碼177個氨基酸，在人體多種組織中廣泛分布。前期研究發現，LCMR1基因的表達水平可以影響肺癌細胞的凋亡[2]，并且對癌癥的侵襲性起關鍵作用[3]。肺癌的發生發展在體內存在復雜的信號網絡，本研究通過酵母雙雜交技術及免疫共沉淀、GST pull-down篩選及驗證LCMR1基因與其相互作用的蛋白，為肺癌的研究機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 誘餌質粒pGBKT7-LCMR1、pGEX-5T質粒、pGEX-5T-LCMR1質粒、pCMV-Myc質粒及pcDNA3.0-flag質粒由本實驗室前期構建并保存。pGBKT7 Cloning Vector、陽性對照載體pCL1、酵母菌株AH109、Matchmarker試劑盒購自美國Clontech公司，感受態大腸桿菌DH5α購自北京天根生物公司。人胚腎293細胞、A549細胞、95D細胞、大腸桿菌BL21由我室保存。質粒提取純化試劑盒購自美國QIAGEN公司，GST Bind Resin購自美國Novagen公司，TNT T7 Quick體外翻譯轉錄試劑盒購自美國Promega公司。Flag標簽抗體購自Sigma公司，Myc標簽抗體購自Abcam公司，β-acting抗體購自SantaCruz公司。

1.2 誘餌質粒轉化入AH109 復蘇轉化有pGBKT7-LCMR1的凍存菌液于LB培養液中，37 ℃、200 r/min過夜振蕩培養，增菌后提取質粒pGBKT7-LCMR1。按照Clontech說明書將pGBKT7-LCMR1轉化入AH109中，AH109/pGBKT7作為空載體對照，轉化后的各組菌液取100 μl 接種至SD/- Trp平板，30 ℃倒置培養，觀察克隆生長情況。未轉化質粒的AH109作為陰性對照，接種至YPDA培養液中，30 ℃ 250 r/min振蕩培養18～20 h。從SD/-Trp平板上挑取1個轉化了誘餌載體的AH109菌落，加入YPDA培養液中30 ℃ 250 r/min振蕩培養，提取酵母蛋白，Western blot 驗證BD-LCMR1 融合蛋白的表達。……