納米硅以及納米三氧化二鐵對大鼠中樞神經行為的影響

潘洋 張鑫源

納米二氧化硅（nano-Si）及納米氧化鋅（nano-Fe2O3）被人們大量使用，其主要應用在紡織工業(yè)、塑料制造以及涂料等領域，因此，納米顆粒物與人接觸的概率較大。在關于納米顆粒物的相關研究中，納米顆粒物可以由皮膚、呼吸道、藥物及腸胃等方式進入體內，隨后通過參與血液和淋巴系統(tǒng)的循環(huán)逐步影響到身體各個器官。國內外大量有關納米材料在毒性方面的研究表明，納米材料可通過多種方式作用于血腦屏障，如血液循環(huán)，破壞了血腦屏障的功能，造成血腦屏障紊亂，使納米顆粒物入侵大腦，在一定程度上影響了中樞神經系統(tǒng)，使神經行為產生變化[1-10]。本研究通過灌胃對Wistar大鼠進行藥物干預，分別觀察納米二氧化硅和納米氧化鋅作用于大鼠時，是否會對神經行為造成改變，并進行討論，從而證明大鼠的中樞神經系統(tǒng)會被這兩種納米顆粒物造成一定的損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康成年Wistar大鼠40只，體重160～180 g，由軍事醫(yī)學科學院動物中心提供，動物許可證號SCXK-（軍） 2002-001。動物隨機分為5組：對照組（C組）、nano-Si高劑量組（SH組）、nano-Si低劑量組（SL組）、nano-Fe2O3高劑量組（FH組）、nano-Fe2O3低劑量組（FL組），每組8只。nano-Si購于上海潤河納米研究科技有限公司，nano-Fe2O3由國家納米中心提供，兩種納米顆粒物粒物直徑大小為20～40 nm。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立 采用灌胃的方式進行藥物干預，實驗組給予生理鹽水懸濁液及納米顆粒物，對照組給予生理鹽水，實驗組在干預前進行5 min的懸濁液震蕩，避免納米顆粒物的沉積。灌胃藥物的劑量分別為低劑量組給予（25 mg/kg），高劑量組給予（100 mg/kg）。進行28 d的藥預，每周測量大鼠的體重變化。

1.2.2 行為學實驗 （1）曠場實驗：該裝置是由黑色膠板制作的長方體敞箱，高50 cm，底面為邊長100 cm的正方形，劃分為25個等邊方格。于上午8：00-10：00在安靜房間內進行此試驗。大鼠在中心方格內進行3 min分實驗，觀察大鼠3 min內后肢直立次數(shù)、大便粒數(shù)、穿越的格數(shù)、修飾次數(shù)。在每次實驗測試結束后，對箱子內部進行清理，從而保障下次實驗的準確度，避免下一只大鼠在測試中受到干擾，干預前及干預結束后分別測量一次。（2）Morris水迷宮實驗：裝置為內分4個象限的正圓小水池，直徑150 cm，池中任選一個象限，在其中央放置一面積10 cm×10 cm 的正方形透明站臺，隱蔽于水面下1～2 cm，水溫（20±2）℃。實驗中水迷宮附近參照物（包括實驗人員觀察時所占的方位）保持不變。定位航行試驗：連續(xù)4 d，訓練3次/d。將大鼠面對池壁，使其依次從其他三個非平臺象限進入水中。記錄逃避潛伏期，即從大鼠開始尋找平臺直到爬至平臺上所用時間。如果1 min后，大鼠仍不能找到平臺，則實驗員將其引至平臺上，此時逃避潛伏期只記為60 s。大鼠爬上平臺后在平臺上停留20 s，兩次訓練間歇60 s休息時間，訓練結束后迅速擦干大鼠。空間探索實驗：訓練第5天移除水下平臺，將大鼠由任一象限放入水中，觀察3 min自由游泳時間內大鼠在目的象限（原平臺象限）的游泳時間。在實驗干預前，對所有組別實驗動物的各項行為學指標的基線值進行了測驗，各組動物的行為指標相比無差異，表明各項行為指標在暴露測試前條件均衡。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析處理，計量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體重增幅比較 完成實驗模型的制造后，SH組大鼠體重為（121.69±9.87）g，C組為（120.59±8.42）g，F(xiàn)H 組（119.87±8.69）g，SL 組（119.73±10.19）g，F(xiàn)L組（123.79±12.17）g，各組間大鼠的體重變化比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表示兩種納米顆粒物并未對體重造成很大影響。

2.2 曠場實驗結果比較 穿行格數(shù)曠場實驗結果顯示，SH、FH組與C組相比較，均明顯減少，比較差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.312、4.005，P＜0.05）；而低劑量兩組（SL組、FL組）分別與C組進行比較，實驗結果雖然有減少趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。直立次數(shù)實驗結果顯示，SH組、FH組與C組進行比較，直立次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.367、5.091，P＜0.05）；而低劑量兩組（SL組、FL組）分別與C組相比，雖然有減少趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。修飾次數(shù)實驗結果顯示，SH組、FH組與C組相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.578、0.108，P＞0.05）。大便粒數(shù)實驗結果顯示，SH組、FH組與C組相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.441、0.487，P＞0.05）。見表1。說明兩種納米物質高劑量組對大鼠的穿行格數(shù)、直立次數(shù)有較為明顯的影響，但是對修飾次數(shù)和大便粒數(shù)沒有明顯的影響。而低劑量組對大鼠的穿行格數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)及大便粒數(shù)四項測試均沒有明顯的影響，因此說明納米顆粒物劑量達到一定水平時，對大鼠的穿行格數(shù)及直立次數(shù)有直接的影響。

表1 各組曠場實驗間結果比較（±s）

表1 各組曠場實驗間結果比較（±s）

*與對照組比較，P＜0.05。

組別 穿行格數(shù)（格） 直立次數(shù)（次） 修飾次數(shù)（次） 大便粒數(shù)（粒）C 組（n=8） 79.21±21.28 13.00±3.65 2.96±0.78 2.77±0.63 SL 組（n=8） 68.58±9.66 9.70±2.93 2.39±0.74 3.14±0.97 SH 組（n=8） 44.60±8.17* 6.93±1.46* 3.17±0.67 2.94±0.89 FL 組（n=8） 64.89±9.96 9.78±1.95 2.26±0.59 2.33±0.65 FH 組（n=8） 46.60±9.05* 5.97±1.39* 3.01±1.05 2.94±0.76

2.3 水迷宮實驗

2.3.1 定位航行試驗 隨著訓練的不斷增加，各組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短。實驗高劑量組大鼠每天逃避潛伏期明顯長于C組，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而實驗低劑量組大鼠較對照組增長差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。通過水迷宮實驗可見，大鼠在逃避潛伏期時間上，SH組與C組Day1、Day2、Day4進行比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.665、2.361、3.049，P＜0.05），Day3兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。FH組與C組Day1、Day2、Day4進行比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.402、2.12、4.185，P＜0.05），Day3兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而SL組、FL組分別與對照組進行比較，差異均無統(tǒng)計續(xù)學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期結果比較[s，（±s）]

表2 各組水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期結果比較[s，（±s）]

*與對照組比較，P＜0.05。

組別 Day1 Day2 Day3 Day4 C組（n=8） 29.93±4.15 10.54±5.49 6.47±2.09 2.46±0.98 SL組（n=8） 29.85±5.27 11.17±7.79 7.03±1.86 2.87±0.68 SH組（n=8） 37.16±3.73*16.59±4.73*9.41±3.52*5.79±2.93*FL組（n=8） 30.73±8.49 11.68±5.79 6.43±2.69 2.73±1.19 FH組（n=8） 38.79±9.57*17.31±7.17*9.45±5.17*6.01±2.19*

2.3.2 空間探索實驗 測試目標象限游泳時間 顯 示，SH 組 為（87.13±10.93）s，C組 為（103.55±17.64）s，F(xiàn)H 組（90.63±8.73）s，F(xiàn)L 組（102.04±15.74）s，SL組（99.61±9.76）s， 實 驗高劑量組大鼠目標象限游泳時間明顯短于C組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而其他兩組低劑量組分別與C組進行比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此說明兩種納米物質的劑量的高低，對大鼠目標象限游泳時間有直接的影響。

3 討論

納米顆粒在物理化學領域中有著其獨特的作用，普遍在很多領域都有使用，人們與納米顆粒物接觸的機會較多，而納米顆粒的安全性也越來越受到人們的關注[11]。由于人體最重要的中樞神經系統(tǒng)，會被納米顆粒物視為潛在的靶器官，納米顆粒物對神經系統(tǒng)造成的毒性影響值得研究[12-13]。目前國內外相關學者通過對不同粒徑納米TiO2的研究，觀察其在大鼠體內的分布和毒性，實驗結果發(fā)現(xiàn)，TiO2進入大鼠體內2周輕度地損害了大鼠的腦部，使海馬神經元發(fā)生脂肪變性[14-15]。相關研究顯示，給予納米氧化鋁對大鼠鼻腔進行不同劑量的滴注后，對其分別進行跳臺實驗、曠場試驗和Morris水迷宮試驗，實驗結果表明，大鼠的記憶力和學習能力出現(xiàn)了減退，而納米氧化鋁的毒性作用很大程度上是這些退化的主要因素[17]。

為了解大鼠的焦慮情況和探索學習能力，筆者通過曠場試驗觀察得出了大鼠的應激、活動、興奮性和探究性行為。研究結果表明，納米顆粒物干預高劑量組中的大鼠探索行為能力和興奮性均有較明顯的降低，然而緊張程度卻相對較高，與對照組相比，適應新環(huán)境的能力較差。在Morris水迷宮定位導航實驗中，各組大鼠的逃避潛伏期時間均有所進步，這一結果表明，大鼠能夠在一段時間的訓練后準確地找到水下平臺[18-20]。

本研究結果表明，納米顆粒干預高劑量組大鼠與對照組大鼠相比對新環(huán)境的適應性較差，具體表現(xiàn)為探索行為與興奮性降低，緊張程度則有所提高。在Morris水迷宮實驗中，各組大鼠的定位航行實驗中，逃避潛伏期均逐漸縮短，表明大鼠可以經過學習訓練來準確地尋找到水下平臺，但學習記憶能力存在明顯差異。大鼠的記憶、學習能力尤其是記憶與空間學習能力通過水迷宮實驗進行測驗較為準確可靠。實驗結果表明，大鼠通過胃灌而留存于體內的納米顆粒物，能夠對大鼠的記憶力和空間學習能力造成影響，實驗過程中水迷宮實驗第三天兩組高劑量組的實驗數(shù)據(jù)分別與對照組進行比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），由于樣本量不夠大，不同納米物對大鼠造成的影響程度存在差異，是造成該結果無統(tǒng)計學意義的主要原因之一。

綜上所述，為評價納米顆粒物對大鼠神經行為造成的影響，對Wister大鼠進行了曠場實驗以及Morris水迷宮實驗，并發(fā)現(xiàn)劑量為100 mg/kg的納米顆粒物可以在一定程度上損傷大鼠的神經行為。然而，由多種機制共同作用才會對神經行為造成改變。因此，納米顆粒物作用于神經行為并使其發(fā)生改變的具體機制仍有待進一步探究。