生姜總酚對腦梗死模型大鼠神經功能的影響

余 恒,宋光捷

腦梗死是臨床常見的腦血管疾病，發病率、致殘率、病死率均較高，嚴重威脅人類健康[1]。腦梗死后遺癥病因復雜，盡管國內外學者對其病理機制進行了大量研究，但臨床仍缺乏特效治療手段。近年來，神經干細胞移植療法給腦梗死后遺癥患者帶來了福音，但仍存在存活不易、穿透瘢痕組織難度大、成瘤性等多種問題[2-3]。因此，研究腦梗死損傷機制，尋找新的有效治療藥物具有迫切性。生姜是姜科多年生草本植物姜的新鮮根莖，具有發散、止嘔、止咳等功效，且藥理作用廣泛[4]。生姜乙醇或水提取物能夠上調腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織過氧化物歧化酶(SOD)表達，下調丙二醛(MDA)表達，降低大鼠血液纖維蛋白原水平，抑制膽堿酯酶活性，從而有效改善神經功能癥狀，提高認知、記憶功能。生姜總酚是生姜的主要成分，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚等多種含有酚羥基的化學物質[5-8]。本研究旨在探討生姜總酚對急性腦梗死模型大鼠神經功能的作用，以期為腦梗死后遺癥治療提供新的思路，現報告如下。

1 材料與方法

1.1藥物 生姜系獲贈于河南省中醫藥研究院中藥分析實驗室。采用色譜柱分離、高效液相色譜等方法制備生姜總酚。臨用時采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液將生姜總酚制備成0.1%濃度的混懸液。6-姜酚(純度≥98.0%)、8-姜酚(純度≥96.0%)、6-姜烯酚(純度≥98.0%)標準品均購自成都德思特生物技術有限公司。采用紫外分光光度法測定生姜總酚含量，對照品為6-姜烯酚，波長為280 nm，測得生姜總酚含量為95.12%。

1.2實驗動物 SPF級雄性裸大鼠30只，體質量200～250 g，由北京維通利華實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2015-0002；飼養于我院動物中心實驗室SPF環境中，溫度(24±2)℃，濕度30%～60%，常規自由飲食，每天日照12 h，通風良好。實驗時對實驗動物的處理方式符合動物倫理要求。

1.3試劑與儀器 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；一抗為鼠抗Caspase-3單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；羊抗鼠二抗購自北京搏奧森公司；Caspase-3檢測試劑盒購自美國Biovison公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1動物分組：選取30只環境適應良好的大鼠，進行編號，采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、生姜總酚組，每組10只。

1.4.2建立模型：采用經典的Longa法建立大鼠大腦中動脈阻塞模型[9]。模型組與生姜總酚組均經腹腔注射30 g/L水合氯醛10 ml/kg，充分顯露左頸動脈，按血流走向行頸內、外動脈分離，對甲狀腺動脈、左側枕動脈予以結扎處理，在近心端與頸內動脈結扎處相距約1.0 mm位置做一小切口，由開口處插入線栓，約19 mm深度，將含線栓的血管進行結扎，再逐層縫合皮下組織及皮膚。術后2 h內，若見大鼠表現出精神不振，同側Horner征，而對側前肢下垂、內旋，并不自主地朝患側轉圈，則表明模型建立成功。若未見該表現，則表明模型建立失敗，予以剔除。術后2 h行Bederson神經功能評分[10]，對于評分為0分或4分者，予以剔除；手術過程中出現死亡的大鼠，也予以剔除；剔除大鼠予以重新補充，保證每組10只。假手術組除不進行插入線栓操作外，余同模型組與生姜總酚組。

1.4.3干預方法：造模后30 min，生姜總酚組予以0.1%生姜總酚混懸液10 ml/kg灌胃，1/d,連續7 d。假手術組與模型組予以等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.4.4大鼠神經功能評估：于術后7 d，對3組大鼠進行Bederson神經功能評分，以評估神經功能缺損情況。評分標準：神經功能無缺陷，0分；右側前爪不能完全伸展，1分；向患側轉圈，2分；向患側傾倒，3分；無法自發行走、意識喪失，4分；死亡，5分。

1.4.5檢測大鼠腦組織細胞凋亡情況：在完成神經功能評估后，將大鼠處死，取出腦組織，以OCT進行包埋，再應用冰凍切片機切成7 μm厚度切片，并置于玻片上。應用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測，嚴格按試劑盒使用說明書進行操作：玻片以40 g/L多聚甲醛/磷酸緩沖液固定，并以2 mg/ml蛋白酶K溶液處理，再加入100 μl 1×平衡緩沖液于標本區域，孵育30 min，之后棄液體，將50 μl TdT孵育緩沖液滴于玻片上，置于37℃環境下，孵育60 min，以磷酸緩沖液洗滌3次，每次5 min，然后用濾紙吸干殘留的磷酸緩沖液。熒光顯微鏡下觀察，分析樣本。隨機選取梗死灶周圍10個高倍(×400)視野，統計凋亡細胞數目。

1.4.6檢測大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達水平：將腦組織放置于液氮中，以研缽研碎，放置在1×上樣緩沖液中，100℃恒溫金屬浴中煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白質轉移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉于37℃下封閉2 h，加一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，然后采用ECL PLUS化學發光，得顯影、定影后的X光膠片，并以β-actin作為內參。采用quantity one 4.62軟件定量測定蛋白條帶密度，計算目的蛋白表達水平，取3次測定結果平均值。

2 結果

2.1Bederson神經功能評分 假手術組、模型組和生姜總酚組的Bederson神經功能評分分別為(0.30±0.08)分、(1.98±0.64)分和(1.25±0.37)分。3組大鼠Bederson神經功能評分比較差異有統計學意義(P<0.05)。模型組和生姜總酚組Bederson神經功能評分高于假手術組，而生姜總酚組低于模型組(P<0.05)。

2.2腦組織細胞凋亡情況 假手術組、模型組和生姜總酚組的腦組織細胞凋亡數目分別為(7.76±2.13)個、(35.12±6.23)個和(27.56±6.47)個。3組大鼠腦組織凋亡細胞數目比較差異有統計學意義(P<0.05)。模型組和生姜總酚組腦組織凋亡細胞數目多于假手術組，而生姜總酚組少于模型組(P<0.05)。3組大鼠腦組織凋亡細胞免疫熒光染色顯示，腦組織正常細胞核呈藍色，凋亡細胞呈綠色。見圖1。

圖1 3組大鼠腦組織免疫熒光染色結果(×400) A為假手術組，B為模型組，C為生姜總酚組

2.3腦組織Caspase-3表達水平 假手術組、模型組和生姜總酚組腦組織Caspase-3表達水平分別為0.29±0.08、1.12±0.24和0.63±0.19。3組大鼠腦組織Caspase-3表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。模型組和生姜總酚組腦組織Caspase-3表達水平高于假手術組，而生姜總酚組低于模型組(P<0.05)。見圖2。

圖2 3組大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達情況

3 討論

腦梗死神經損傷機制與康復治療對策長期以來一直是臨床研究的熱點與難點。目前臨床用于腦梗死研究的大鼠模型種類較多，包括光化學法誘導建模、線栓法等。本研究采用線栓法建立實驗模型，該模型是利用線栓將動脈血管血流阻斷，能夠較真實地模擬急性腦梗死的發病過程，且該建模方式具有操作簡單、構建成功率高、重復性良好、梗死灶穩定等多種優勢，在臨床研究腦缺血疾病的實驗中應用廣泛[11-13]。

生姜是一種傳統中藥，可行解表散寒、化痰止咳之功，近年來有關其對腦缺血疾病治療作用的研究報道逐漸增多。研究表明，生姜汁、生姜提取物對慢性腦缺血、缺血再灌注損傷模型大鼠有治療作用，能夠減少梗死灶體積，改善神經癥狀，而其改善腦組織能量代謝、清除氧自由基、抑制鈣超載、抑制神經細胞凋亡可能是相關作用機制[14]。《中國藥典(2015版)》指出，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等是評價生姜質量的重要成分[15]。生姜總酚提取自生姜，具有抗氧化、調節血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用[16]。已有研究顯示，生姜總酚能夠減輕大鼠腦缺血損傷，對神經功能有顯著保護作用[17]。本研究結果顯示，與模型組比較，生姜總酚組Bederson神經功能評分明顯降低，提示生姜總酚能夠改善腦梗死模型大鼠神經功能，具有肯定的神經功能保護作用。

腦梗死后，腦組織神經細胞大量凋亡，從而引起神經功能損傷[18-19]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組與生姜多酚組腦組織凋亡細胞明顯增多，證實細胞凋亡是腦梗死后神經功能損傷的病理機制。有研究表明，生姜具有抑制神經細胞凋亡的作用[20]。本研究結果顯示，與模型組比較，生姜總酚組凋亡細胞數目明顯減少，提示生姜總酚能夠抑制腦梗死模型大鼠腦組織神經細胞凋亡，與既往報道類似。細胞凋亡指生理、病理狀態下，機體為維持內環境穩定而出現的細胞程序性死亡，其受分子水平調控[21]。Caspases蛋白酶家族，在細胞凋亡過程中起著至關重要的作用，凋亡的最后實施是通過Caspases的激活而實現的，此為凋亡調控的共同機制。而Caspase-3是Caspase級聯反應中的主要執行者，能夠通過特異性裂解一系列底物而致細胞凋亡[22]。為探討生姜總酚抑制腦梗死神經細胞凋亡的作用機制，本研究還采用蛋白免疫印跡法檢測了Caspase-3蛋白表達水平，結果發現，與模型組比較，生姜總酚組腦組織Caspase-3蛋白表達水平明顯降低，提示降低腦組織Caspase-3蛋白表達水平可能是生姜總酚抑制腦梗死模型大鼠腦組織神經細胞凋亡的重要機制之一。

綜上所述，生姜總酚能夠減輕腦梗死大鼠神經功能損傷，具有神經功能保護作用，可能是通過下調凋亡相關因子Caspase-3表達，抑制腦組織細胞凋亡來實現的。生姜總酚及相關作用靶點可為腦梗死治療提供新思路、方法，值得深入研究。