淋巴細胞主動免疫治療復發性流產前后血清免疫組學比較

郝莉娜

陜西省榆林市第一醫院婦產科(榆林719000)

主題詞 流產/治療 免疫療法, 主動 淋巴細胞

不明原因復發性流產(Unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)是產科在臨床中面臨的巨大挑戰，隨著免疫學的不斷發展，認為這可能是由于母親與孩子雙方免疫不合而導致母體對胎兒排斥造成流產[1-2]。目前淋巴細胞主動免疫是治療URSA最有效的方法，可通過封閉所產生的抗體，阻止胚胎遭受母體免疫系統的攻擊[3]。本文旨在評價封閉抗體(Blocking antibody，BA)的療效，同時分析BA能提高妊娠率的原因。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年1月至2017年5月我院收治的不明原因復發性流產患者54例，基本情況如下：平均年齡(27.39±2.47)歲，BMI值為(20.54±1.25)，月經周期(27.84±2.49) d。納入標準：①子宮及雙側附件正常，無其他器質性病變，月經周期處于正常范圍內之內；②丈夫精子狀況良好；③BA陰性(-)；④D-二聚體、纖維蛋白降解產物FDP、全血分析無血栓形成異常；⑤流產次數≥2次且流產期在5～12周；⑥無重大臟器病變；⑦近期未服用過藥物；⑧本人簽署知情同意書。排除標準：①染色體、內分泌、自身免疫異常以及陰道感染所致的復發性流產；②不孕不育抗體陽性；③丈夫染色體、內分泌異常，生殖器感染；④有正常或死胎產史。

2 方 法

2.1 淋巴細胞主動免疫治療：空腹抽取符合肝病毒、肝功、生化、血脂、HIV、梅毒標準的血液30 ml，采用Ficoll密度梯度離心法在無菌條件下收集淋巴細胞，生理鹽水洗滌2次，將密度為3×1010/L的淋巴細胞懸浮液3 ml從前臂三角肌進行皮內注射，每2周注射1次，4次為1個療程，治療過程中避孕。1個療程結束后14 d，空腹抽血檢測患者HLA-Ⅰ、Ⅱ抗體，若為陽性在3個月內妊娠；若仍為陰性，追加1個療程，妊娠成功后再追加1個療程，成功產下活胎視為妊娠成功。

2.2 封閉抗體檢測方法:采用ELISA試劑盒(美國 ONELAMBDA公司)檢測BA，空腹抽3 ml外周血，分離血清，具體步驟見說明書。

2.3 血清免疫學檢測:采用流式細胞儀(FACSCalibur 美國BD公司)測定T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+、CD16+CD56+。免疫球蛋白IgG、IgM、IgA采用免疫比濁法進行檢測。

2.4 隨診:治療期間密切觀察陰道是否出血，懷孕7～12周B超復查，定期進行常規孕婦體檢。

結 果

1 治療后BA表達與妊娠情況 見表1。淋巴細胞主動免疫治療后，BA陽性(+)組的妊娠成功率為91.4%，遠高于BA(-)組(36.8%)，差異具有統計學意義(P<0.05)；BA(+)組妊娠失敗率為8.6%(3/35)，BA(-)組妊娠失敗率為63.2%(12/19)，差異具有統計學意義(P<0.05)；治療后的總妊娠成功率為72.2%(39/54)。

表1 治療后BA與妊娠情況[例(%)]

2 治療前后T細胞亞群變化 見表2。淋巴細胞主動免疫治療后，BA(+)組的T細胞亞群CD3+和CD8+數量明顯增多，CD4+、CD4+/CD8+以及 CD16+CD56+的數量顯著降低，與治療前相比，差異均存在統計學意義(P<0.05)，而治療后BA(-)組CD3+、CD8+、CD4+、CD4+/CD8+以及 CD16+CD56+的數量與治療前比無統計學差異(P>0.05)，但與治療后的BA(+)組患者鼻，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 治療前后兩個亞組T細胞亞群變化

注：與治療前比較，*P<0.05 ；與治療后BA(+)組比較，#P<0.05

3 治療前后外周血免疫球蛋白變化 見表3。淋巴細胞主動免疫治療后，BA(+)組IgG和IgM表達明顯降低(P<0.05)，IgA表達沒有顯著性變化(P>0.05)，BA(-)組與治療前相比IgA、IgG和IgM表達均無明顯變化(P>0.05)；與治療后BA(+)比，BA(-)組IgA、IgG明顯升高(P>0.05)，IgA略升高，但兩者間差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 外周血免疫球蛋白變化

注：與治療前比較,*P<0.05;與治療后BA(+)組比較,#P<0.05

討 論

復發性流產(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是育齡婦女的常見疾病之一，其病因包括感染、內分泌異常、染色體異常、胚胎畸形等[4]。據統計仍有近50%的RSA病因不明，導致治療效果不理想使其成為難治性不孕癥，臨床將這一類復發性流產稱之為URSA(不明原因復發性流產)[5]。隨著生殖免疫學不斷的研究，認為這可能是與母胎雙方免疫不合有關[6-8]。胎兒在孕婦體內時，有一半基因來自父親，屬于外來異物，普通正常機體會產生排斥反應，但孕婦自身會對抗這一排斥形成封閉抗體，以保護胚胎的存活[9]；如果母親缺少這種封閉抗體，體內免疫細胞便對胚胎開始攻擊，最終造成流產[10]。目前，臨床常用丈夫或第三者血型匹配的淋巴細胞進行主動免疫治療，淋巴細胞進入育齡婦女體內后反復刺激形成人抗白細胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)，進一步合成抗滋養細胞交叉抗原封閉抗體(TLXBA)，當再次妊娠時TLXBA可識別胚胎上異源性抗原并結合，避免母體對胚胎的免疫攻擊，充分保護胚胎在母體的生長發育[11-12]。在本研究中，給予54例患者治療后，妊娠成功率為72.2%，這說明淋巴細胞主動免疫治療對BA缺乏的URSA患者效果顯著，這一結果與目前的臨床研究結果一致。通過進一步分析BA(+)組與BA(-)組的妊娠成功率發現，治療后35例BA陽性的URSA患者妊娠成功率為91.4%，19例BA陰性的URSA患者妊娠成功率為36.8%，兩者相比差異具有統計學意義，這一結果說明封閉抗體對胎兒的存活提供有利的生長環境，BA陽性是妊娠成功的關鍵。

大量研究表明CD4+和CD8+的T細胞對機體免疫平衡的維持至關重要，為了證明淋巴細胞主動免疫治療后機體免疫平衡對妊娠率的提高存在的聯系，我們檢測了治療前、治療后BA(+)組、治療后BA(-)組的T細胞亞群和外周血免疫球蛋白的變化。CD8+T細胞主要分為Tc1和Tc2兩種，Tc2細胞分泌的細胞因子Th2有利于妊娠，從我們的研究結果中可以得到治療后BA+組的CD8+亞群數量增加，這可能是因為Tc2細胞不斷增殖導致細胞因子Th2增多，提高了妊娠成功率。CD56和CD16是NK細胞表面特異性分子[13]，CD56+CD16-型NK細胞占90%具有免疫抑制作用，CD56+CD16+型NK細胞占10%具有免疫營養作用，前者可以在細胞因子Th1的作用下轉化為后者，后者細胞毒性強可發揮免疫防御作用。從實驗結果當中可知，治療后BA(+)組的CD56+CD16+型NK細胞數量顯著降低，我們猜測這一現象是因為治療后機體Th2因子數量不斷增加導致Th1因子的數量減少(Th1與Th2在體內具有交叉調節作用)，使得CD56+CD16-型向CD56+CD16+型轉化的NK細胞數量減少，CD56+CD16+型細胞減少意味著細胞毒性的降低，促進胚胎在母體的正常發育。

回顧本次研究，已經證實BA的表達對妊娠成功具有重要的意義，并且治療后BA(+)組仍存在妊娠失敗率8.6%，我們猜測如果對BA表達進行量化，就能確定妊娠成功時BA的臨界點，這為BA治療提供了一個標準，就會提高治療效率。當淋巴細胞主動免疫治療后BA(-)占總體治療人數的35.2%(19/54)，如果將治療個體化，提高治療后BA的陽性率，最終也能提高妊娠成功率，這都需要我們今后進一步的研究。