黃芪莖葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

黃文靜，周 瑞，張嚴(yán)磊，王 楠，王二歡，田 鑫，2，孫建霞，2，唐志書，2

(1陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽 712083；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽 712046；3陜西步長制藥有限公司，西安 710077)

黃芪具有雙向調(diào)節(jié)血糖、降血壓、抗心肌缺血和增強機體免疫力等藥理作用，應(yīng)用非常廣泛[1-4]。由于市場對黃芪的需求量逐年增加，其種植規(guī)模不斷擴(kuò)大[5-8]。黃芪莖葉中含有大量的黃酮類化合物，但在其主產(chǎn)區(qū)每年藥材采挖后地上莖葉往往丟棄，因此造成巨大的浪費。本研究通過正交試驗采用醇提法從黃芪莖葉中提取總黃酮，同時對其進(jìn)行抗氧化活性分析，以期為黃芪莖葉黃酮類物質(zhì)的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

本試驗用黃芪為蒙古黃芪和膜莢黃芪混交種，其地上部分莖葉于9月上旬采自甘肅省隴南市宕昌縣阿塢鄉(xiāng)麻界村黃芪種植基地。將割取的黃芪莖葉置于陰涼處晾干，粉碎機粉碎后裝于塑料袋中避光密封保存。

95%乙醇、無水乙醇、Tris、鄰苯三酚、水楊酸、鹽酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等化學(xué)試劑，陜西樂博生化試劑有限公司，均為分析純；DPPH、維生素C標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，陜西標(biāo)普醫(yī)藥科技有限公司。

高速粉碎機(廣州美的)、UV-2600紫外分光光度計(日本島津)、HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒)、電子天平(北京賽多利斯)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊)、RE-200A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器)、超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1總黃酮含量測定 總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[9]。以蘆丁作為對照品，于510 nm 處測定不同濃度蘆丁溶液的吸光值，以吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y=9.322 9X-0.003 9(R2=0.997 7)。

樣品總黃酮含量測定。稱取干燥黃芪莖葉粉末20g，用醇提法進(jìn)行提取。將醇提物烘干后加入50mL 無水乙醇溶解，以無水乙醇為空白，取1mL 醇溶液在510nm處測定光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

樣品提取率=0.002 5X×100%

(1)

1.2.2總黃酮提取工藝 黃芪莖葉總黃酮提取的工藝流程：樣品粉碎→過40目篩→稱重→加入乙醇→回流提取→抽濾→減壓濃縮→烘箱烘干→提取物浸膏。

參考其他植物黃酮提取文獻(xiàn)[10-13]，并根據(jù)前期預(yù)實驗的結(jié)果，選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)和提取時間(D)4個因素對總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化(表1)。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗因素水平

1.2.3總黃酮體外抗氧化活性測定 黃芪莖葉總黃酮對DPPH自由基清除效果的測定。參照徐秀泉等[14]的方法，取不同質(zhì)量濃度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)的黃芪莖葉總黃酮和維生素C溶液1 mL，向其中加入0.2 mmol/L的DPPH 溶液1 mL，搖勻后黑暗處靜置30 min，于517 nm 處測定吸光值，測定3次取平均值。

DPPH 清除率(%)=1-(Ai-Aj)/Ao×100

(2)

式(2)中，Ao為1mL DPPH溶液和1mL70%乙醇反應(yīng)后的吸光值、Ai為1mL DPPH溶液和1mL 樣品溶液反應(yīng)后的吸光值、Aj為1mL樣品溶液和1mL 的70%乙醇反應(yīng)后的吸光值。

黃芪莖葉總黃酮對羥基自由基清除效果的測定。參照侯學(xué)敏等[15]的方法，取不同質(zhì)量濃度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)的黃芪莖葉總黃酮和維生素C溶液1 mL(蒸餾水為對照)，向其中分別加入9mmol/mL的硫酸亞鐵溶液和水楊酸-乙醇溶液各1mL，再加入30%過氧化氫溶液1mL，35℃水浴35min后于510nm波長處測其吸光度。由于樣液本身具有吸光度，測其本底值時用蒸餾水代替過氧化氫。

羥基自由基清除率(%)=[Ao-(Ax-Axo)]/Ao×100

(3)

式(3)中，Axo是本底吸光度、Ax是加入樣品溶液后的吸光度、Ao是空白對照吸光度。

黃芪莖葉總黃酮對超氧陰離子自由基清除效果的測定。參照陳晉明等[16]的方法，取不同質(zhì)量濃度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)的黃芪莖葉總黃酮和維生素C溶液1 mL(蒸餾水為對照)，向其中分別加入4.5 mL的Tris-HCl溶液(pH 8.2)和3.2 mL蒸餾水，混勻后35℃預(yù)熱10 min，然后立即加入預(yù)熱的3 mmol/L 鄰苯三酚0.5 mL，室溫下反應(yīng)5min后向其中加入2滴8mol/LHCl終止反應(yīng)，于波長320 nm 處測吸光度。

超氧陰離子自由基清除率(%)=(1-Ao/Ax)×100

(4)

式(4)中，Ao為對照的吸光度、Ax為加入樣品后的吸光度。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用Excel處理作圖，正交試驗分析及方差計算使用正交設(shè)計Ⅱ?qū)I(yè)版進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪莖葉總黃酮提取的正交試驗分析

總黃酮的提取率在1.14%～3.825%之間，根據(jù)極差分析可知，總黃酮提取工藝中各因素對提取率的影響程度為D>A>B>C，最優(yōu)組合為A3B1C1D3，即乙醇濃度為90%、料液比為1∶10、提取溫度為60℃、提取時間為1.5 h(表2)。由表3可知，乙醇濃度和提取時間對總黃酮提取率的影響顯著，提取溫度與料液比對結(jié)果影響不顯著。

表2 總黃酮提取條件的正交試驗結(jié)果與分析

表3 正交試驗結(jié)果方差分析

注：*對結(jié)果影響顯著(P<0.05)，下同

綜合以上考慮，選擇黃芪莖葉總黃酮的提取條件為A3B1C1D3，在此條件下進(jìn)行3次驗證性試驗，總黃酮提取率為3.82%，測定結(jié)果穩(wěn)定，證明該結(jié)果合理可靠。

2.2 黃芪莖葉總黃酮抗氧化活性分析

2.2.1DPPH自由基清除能力 如圖1所示，隨著黃芪莖葉總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐漸提高，在其濃度為0.01mg/mL時，DPPH的清除率僅為57.28%，當(dāng)其濃度上升至0.4mg/mL時，DPPH清除率高達(dá)88.60%。以維生素C為參照，當(dāng)其質(zhì)量濃度均為0.4mg/mL時，黃芪莖葉總黃酮清除DPPH自由基的能力是維生素C的96.09%，說明其具有很強的DPPH自由基清除能力。

圖1 不同質(zhì)量濃度總黃酮和維生素C對DPPH自由基的清除率

2.2.2羥基自由基清除能力 由圖2可知，維生素C和黃芪莖葉總黃酮清除羥基自由基的能力均隨質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)黃芪莖葉總黃酮質(zhì)量濃度由0.01mg/mL升高10倍后，其羥基自由基的清除率從33.26%急劇上升至78.42%；當(dāng)其和維生素C的質(zhì)量濃度均為0.4mg/mL時，其清除羥基自由基的能力是維生素C的89.75%，可知黃芪莖葉總黃酮具有較強的羥基自由基清除能力。

圖2 不同質(zhì)量濃度總黃酮和維生素C對羥基自由基的清除率

2.2.3超氧陰離子自由基清除能力 由圖3可知，黃芪莖葉總黃酮對超氧陰離子自由基清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強，在0.01～0.4 mg/mL內(nèi)，清除率由33.27%上升至85.12%。以維生素C為參照，在黃酮質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，其對超氧陰離子自由基清除能力是維生素C的77.27% 。

圖3 不同質(zhì)量濃度總黃酮和維生素C對超氧 陰離子自由基的清除率

3 結(jié)論與討論

通過對黃芪莖葉進(jìn)行醇提，確定了黃芪莖葉總黃酮提取的最佳工藝，即乙醇濃度為90%、料液比為1∶10、在60℃下提取1.5 h，總黃酮提取率為3.82%。此工藝條件下，90%濃度的乙醇擁有更高的有機相，在60℃下進(jìn)行提取黃酮類化合物不會因高溫破壞結(jié)構(gòu)而分解，與此同時，較低的料液比也可緩解因提取時間變長而引起的成本上升，實驗重復(fù)性好，安全可靠。通過對黃芪莖葉總黃酮進(jìn)行體外抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，其擁有較高的DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力，以維生素C為對照，在0.4mg/mL濃度下其清除3種自由基的能力分別是維生素C的96.09%、89.75%、77.27%。

本研究顯示，通過簡單的醇提加工便可得到具有很好抗氧化效果的黃芪莖葉總黃酮，如將其繼續(xù)開發(fā)為保健產(chǎn)品或食品添加劑，不僅可減少資源的浪費，還可延伸黃芪產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)鏈，具有重要的生態(tài)意義和實踐意義?！?/p>