杏鮑菇黃酮提取工藝的優化

李士慧，梁 婷，寇送波，信 悅，張 諾，王廣慧

(綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化 152061)

杏鮑菇是一種深受人們喜愛的珍稀食用菌，兼具有食用及藥用價值[1-2]，具有十分廣闊的開發前景，但迄今為止，有關于杏鮑菇黃酮提取技術的研究并不是很多，且所獲得的黃酮提取率也很低[3]。本研究嘗試利用超聲波粉碎技術與復合酶解技術相結合的方法提取杏鮑菇黃酮，提取率達到了3.352%，以期為開發杏鮑菇黃酮資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇，綏化市大潤發超市；磷酸氫二鈉、檸檬酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為國產分析純，產自天津市津東天正精細化學試劑廠；木瓜蛋白酶和纖維素酶，武漢諾輝化工有限公司。

1.2 主要儀器

752型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；賽多利斯BSA224S型電子分析天平，德國賽多利斯公司；JY92-ⅡDN型超聲波細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1測定方法 采用硝酸鋁—亞硝酸鈉法測定杏鮑菇中黃酮的含量。標準曲線的繪制及線性回歸方程的獲得方法參見文獻[4]。杏鮑菇黃酮提取率的計算方法如式(1)：

(1)

式(1)中，R——杏鮑菇黃酮提取率(%)；C1——提取液中黃酮含量(g)；C0——杏鮑菇原料質量(g)。

1.3.2超聲波輔助復合酶法提取杏鮑菇黃酮的操作步驟[5-10]將杏鮑菇清洗干凈后切片，用烘箱在50℃下干燥至恒重，掰碎后放入高速萬能粉碎機中粉碎2 min，即制得杏鮑菇干粉。精確稱取每份為3.0 g的杏鮑菇粉若干份，置于燒杯中，按試驗設計要求加入磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，攪拌均勻后用超聲波粉碎機進行處理，然后加入復合酶(木瓜蛋白酶和纖維素酶按質量比1∶1混合)并在恒溫水浴鍋中進行酶解。酶解后在沸水浴中放置5 min以滅酶活，再以3 500 r/min的轉速離心10 min后棄沉淀。在上清液中加入3倍體積的95%乙醇，在4℃冰箱中沉淀12 h，以去除多糖、蛋白質等雜質。離心后吸取上清液1 mL放于 10.00 mL容量瓶中，按照文獻[4]中的方法測吸光值，并根據線性回歸方程和提取率計算公式計算出樣品中的黃酮提取率。每個樣品平行試驗3次。

1.3.3單因素試驗

(1)料液比對杏鮑菇黃酮提取率的影響：取5份杏鮑菇粉，每份3.0 g，分別按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)的料液比設置加入pH 5.4的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，先在400 W的超聲波功率下處理5 min，然后加入樣品量1.20%(W/W)的復合酶并在50℃下酶解浸提60 min。提取后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(2)超聲波功率對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波時間為5 min、酶添加量為1.20%、酶解溫度為50℃、酶解時間為60 min，將5份杏鮑菇粉分別按照超聲波功率為200、300、400、500、600 W進行處理。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(3)超聲時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波功率為400 W、酶添加量為1.20%、酶解溫度為50℃、酶解時間為60 min，將6份杏鮑菇粉分別超聲波處理3、4、5、6、7、8 min。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(4)酶解時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波功率為400 W、超聲時間為5 min、酶添加量為1.20%、酶解溫度為50℃，酶解時間分別設置為30、40、50、60、70 min。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(5)酶解溫度對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波功率為400 W、超聲時間為5 min、酶添加量為1.20%、酶解時間為60 min，酶解溫度分別設置為30、40、50、60、70℃。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(6)酶解pH對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、超聲波功率為400 W、超聲時間為5 min、酶添加量為1.20%、酶解溫度為50℃、酶解時間為60 min，分別在5份杏鮑菇粉中加入pH 5.0、5.4、6.0、6.4、7.0的緩沖液。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(7)酶添加量對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波功率為400 W、超聲時間為5 min、酶解溫度為50℃、酶解時間為60 min，酶添加量分別設置為樣品量的0.60%、0.80%、1.0%、1.20%、1.40%、1.60%。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

1.3.4正交試驗 得到單因素試驗的結果后，從對杏鮑菇黃酮提取率產生較大影響的4個單因素中選擇3個水平進行四因素三水平的正交試驗，確定出超聲波輔助復合酶法提取杏鮑菇黃酮的最優條件。

2 結果與分析

2.1 繪制標準曲線

根據試驗結果繪制標準曲線，得到測定黃酮含量的線性回歸方程為：y=10.908x-0.011 4，R2=0.993。

2.2 杏鮑菇黃酮提取的試驗結果

2.2.1單因素試驗

(1)料液比的影響：由表1可知，在料液比為1∶40時的提取率最高，說明料液比過高或過低都不利于黃酮類化合物的溶出。

表1 料液比對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(2)超聲波功率的影響：由表2可知，超聲波功率為500 W時，杏鮑菇黃酮的提取率最高。推測可能是超聲波功率過高時會破壞黃酮類物質的結構，而功率過低則不利于杏鮑菇細胞的解體。

表2 超聲波功率對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(3)超聲時間的影響：由表3可知，超聲時間為7 min時，黃酮提取率最高。超聲時間過長或過短都不利于黃酮類物質的分離提取。

表3 超聲時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(4)酶解時間的影響：由表4可知，酶解時間為60 min時，黃酮提取率最高。原因可能是酶解時間過短導致酶解反應不完全，而酶解時間過長又會降低酶的活性，這都會降低黃酮的提取率。

表4 酶解時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(5)酶解溫度的影響：由表5可知，酶解溫度為60℃時，黃酮提取率最高。分析可能是過高或過低的溫度都影響了酶的活性，從而導致酶解效率降低。

表5 酶解溫度對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(6)酶解pH的影響：由表6可知，酶解pH為5.4時，黃酮提取率最高。說明此pH最有利于酶活性中心可解離基團的解離，因而酶的活性最高。

表6 酶解pH對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(7)酶添加量的影響：由表7可知，酶添加量為1.4%時，黃酮提取率最高。

表7 酶添加量對杏鮑菇黃酮提取率的影響

2.2.2正交試驗結果 根據單因素試驗結果，在其他因素都固定為最佳值的情況下，選擇料液比、超聲時間、酶解溫度和酶解pH這4個對杏鮑菇黃酮提取率影響較大的因素進行正交試驗(表8、表9)。

表8 正交試驗因素水平

表9 正交試驗結果

3 結論

本文通過單因素及正交試驗設計法對超聲波輔助復合酶法提取杏鮑菇黃酮的工藝條件進行了優化研究。正交試驗的直觀分析結果顯示，當其他影響因素固定為由單因素試驗得到的最佳值時，A(料液比)、B(超聲時間)、C(酶解溫度)、D(酶解pH)4個因素對杏鮑菇黃酮提取率的影響程度為B>D>C>A，4個因素的最佳值分別是B1、D2、C1、A3，即杏鮑菇黃酮提取工藝的最優條件為料液比為1∶50 (g/mL)、超聲時間為6 min、酶解溫度為50℃、酶解pH為5.4，在此條件下進行3次驗證試驗，得到杏鮑菇黃酮的平均提取率為3.352%?！?/p>