營養組合物對再障大鼠干細胞增殖的影響

單宇佳，王華新，趙立芬，劉 兵，楊佩滿 ，吳文國，賈 莉

(1大連醫科大學檢驗醫學院，遼寧大連 116044；2大連醫科大學病理學與法醫學教研室，遼寧大連 116044；3大連醫科大學組織胚胎學教研室，遼寧大連 116044； 4大連金斧生物科技發展有限公司， 遼寧大連 116012)

再生障礙性貧血是由多種病因、多種發病機理引起的一種惡性血液疾病。臨床實驗證據表明，再障中骨髓造血細胞數量極度減少，嚴重限制了對再障發病機制的研究，獲得性骨髓衰竭的動物模型可以幫助深入了解引起骨髓衰竭的機制[1-3]。大多數再障患者會出現厭食、惡心及其他胃腸道癥狀，導致營養不足[4]。再障的治療以免疫抑制治療為主，患者接受治療后，會出現嚴重的消化功能障礙，電解質不平衡和代謝異常，出現并發癥的風險大大增加[5-7]。因此，營養干預成為再障患者治療前后應考慮的重要問題。研究表明，營養組合物在再障小鼠營養康復中發揮了關鍵作用[8-9]。本研究采用X射線、環磷酰胺、氯霉素三聯應用的方法建立再障大鼠模型，探討自制營養組合物對再生障礙性貧血大鼠各器官干細胞增殖的影響，旨在為營養組合物對再障的臨床治療應用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物：SD大鼠100只，大連醫科大學實驗動物中心；營養組合物，大連金斧生物科技發展有限公司，該組合物包含賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、核苷酸、大豆磷脂、維生素C、維生素D、維生素B12、葉酸、鐵、硒等36種物質組成，按原方比率配方，經水煎、超聲、濃縮，配制成口服液，分裝備用；環磷酰胺、氯霉素，上海華聯制藥有限公司；兔抗大鼠CD90、CK19 抗體，兔抗大鼠CD133、OCT4抗體，兔抗大鼠Lgr5、Musashi-1抗體，兔抗大鼠Nestin、CD133抗體，武漢三鷹生物技術有限公司；羊抗兔二抗及SP免疫組化檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 大鼠再障模型的建立

第1天X射線2.5Gy(美國瓦里安2 300C/D，6 MV，X射線，照射距離25cm，劑量率300 cGy /min)照射后，于第4、6、8天分別給予環磷酰胺35mg/kg、氯霉素45 mg/kg腹腔注射。第15天重復以上步驟。正常對照組給予等量生理鹽水相應部位注射。

1.3 實驗分組及流程

根據動物藥理學的藥品劑量和綜合實驗的設計準則，本實驗分為：(1)正常對照組；(2)再障模型組；(3)營養組合物高劑量組，以2 266.95mg/(kg·d)對大鼠灌胃；(4)營養組合物中劑量組，以1 511.3mg/(kg·d)對大鼠灌胃；(5)營養組合物低劑量組，以1 057.91mg/(kg·d)對大鼠灌胃，每組20 只。

實驗流程：應用X射線照射及注射環磷酰胺、氯霉素的方法建立再障大鼠模型。從第5天開始，營養組合物高、中、低劑量組分別以相應劑量對大鼠進行灌胃，每天1次，直至第60天，頸椎脫臼處死大鼠，留取對應的樣品標本進行后期檢測。

1.4 實驗方法

將處死的SD大鼠解剖，留取肝臟、腎臟、胃、腸、腦標本，置于10%甲醛中固定，依次經過常規脫水、石蠟浸泡包埋、切片后進行免疫組織化學染色。步驟如下：石蠟包埋切片、脫蠟、水化；PBS洗片2～3次，每次5min；在玻片上滴加3% H2O2(80%甲醇)，室溫靜置10min；PBS洗2～3次各5min；抗原修復；PBS洗2～3次各5min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。滴加一抗50μL，4℃過夜。過夜后需在37℃復溫45min。PBS洗3次各5min；滴加二抗40～50μL，室溫靜置，或37°C 1h；PBS洗3次各5min；DAB顯色5～10min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10min；蘇木精復染2min，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10～15min；脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5 統計學分析

2 結果與分析

2.1 營養組合物對再障大鼠肝臟干細胞的影響

本研究采用免疫組化檢測再障大鼠肝干細胞標志物CD90、細胞角蛋白19(CK19)的表達情況。結果顯示，與正常對照組相比，再障模型組大鼠肝干細胞數量明顯減少(圖1)，再障大鼠經營養組合物灌胃后，大鼠肝干細胞的含量增加，并且隨著營養組合物劑量增加而增加，表明營養組合物促進再障大鼠肝干細胞的增殖。

2.2 營養組合物對再障大鼠腎臟干細胞的影響

本研究采用免疫組化檢測再障大鼠腎臟干細胞標志物CD133、OCT4的表達情況，結果顯示，與正常對照組相比，再障模型組大鼠CD133、OCT4的表達量顯著降低(圖2)，營養組合物處理再障大鼠后，其表達量隨營養組合物劑量增加而增加，表明營養組合物促進再障大鼠腎臟干細胞的增殖。

2.3 營養組合物對再障大鼠胃干細胞的影響

本研究采用免疫組化檢測再障大鼠胃干細胞標志物Lgr5及Musashi-1的表達。結果顯示，與正常對照組相比，再障模型組大鼠胃干細胞Lgr5的表達量明顯減少(圖3)；營養組合物處理再障大鼠后，Lgr5的表達隨營養組合物劑量增加而增多；然而各組胃干細胞Musashi-1的表達無明顯變化。以上結果表明，營養組合物具有促進再障大鼠胃干細胞的增殖。

圖1 營養組合物對再障大鼠肝臟干細胞的影響(400×)注：# P<0.05 再障組與正常組；*P<0.05 營養組合物組與再障組

圖2 營養組合物對再障大鼠腎臟干細胞的影響(400×)注：# P<0.05再障組與正常組；*P<0.05營養組合物組與再障組

圖3 營養組合物對再障大鼠胃干細胞的影響(200×)注：# P<0.05 再障組與正常組；*P<0.05 營養組合物組與再障組

2.4 營養組合物對再障大鼠腸粘膜干細胞的影響

本研究采用免疫組化檢測再障大鼠腸道干細胞標志物Musashi-1、 Lgr5的表達。結果顯示，各組小腸干細胞數量無明顯變化(圖4)，表明營養組合物對再障大鼠小腸干細胞的增殖無顯著作用。

圖4 營養組合物對再障大鼠肝臟干細胞的影響(200×)注：# P<0.05 再障組與正常組；*P<0.05 營養組合物組與再障組

2.5 營養組合物對再障大鼠神經干細胞的影響

本研究采用免疫組化檢測再障大鼠神經干細胞標志物Nestin、CD133的表達情況，結果顯示，營養組合物處理再障大鼠后，Nestin、CD133的表達無顯著變化(圖5)，表明營養組合物對再障大鼠腦神經干細胞的增殖無顯著影響。

圖5 營養組合物對再障大鼠肝臟干細胞的影響(400×)注：# P<0.05再障組與正常組；*P<0.05營養組合物組與再障組

3 討論

引起再生障礙性貧血(AA)的主要原因為T 淋巴細胞介導的免疫功能發生紊亂，其發病機理為T 淋巴細胞發生異常激活，進而分泌過量的造血負調控因子，通過某些機制抑制造血干/祖細胞增殖分化，從而誘導造血干細胞凋亡，在此過程中表現為明顯的抑制骨髓造血活性[10]。大多數嚴重再障患者采用抗胸腺細胞球蛋白和環孢菌素進行免疫抑制治療來改善血細胞計數及存活率[11]。再障患者另一治療選擇為異基因造血干細胞移植[12]。此外，支持治療、預防感染和輸血支持對于再障患者也是至關重要的[13]。雖然臨床上已有較完善的治療方法和指征，但實際療效仍然不理想。因此，探討營養組合物治療再障大鼠的可能作用機制具有較高的臨床意義。

營養組合物含有多種氨基酸、磷脂、核苷酸等多種營養成分，其中腦磷脂、卵磷脂是線粒體及造血干細胞組分，甘氨酸參與合成甘氨酰胺合成酶參加嘌呤核苷酸合成。據報道，營養組合物具有促進造血干細胞增殖和增強血紅蛋白合成的功能。此外，核苷酸類營養物不僅有助于基因的復制、損傷基因的自主修復、基因表達，也有助于線粒體的增殖[14]。有研究學者發現，在AA小鼠模型中，營養組合物對骨髓造血微環境有明顯的保護和修復作用，可促進小鼠干細胞增殖和增加線粒體的數目[15]。

Wilson等[16]證實了增殖的卵圓細胞可分化為成熟的肝細胞及膽管細胞，并指出這類細胞為肝臟內原始肝干細胞。國內研究報道，當肝臟受到藥物刺激或其他原因造成嚴重損傷肝時，卵圓細胞可被激活并增殖、分化為肝實質細胞和膽管上皮細胞，使得肝功能得以重建和修復[17]。腎小管上皮細胞具有免疫調節作用，在腎組織損傷修復過程中具有強大的再生能力[18-22]，這種強效的再生可有效恢復腎臟功能。腎臟組織干細胞對于維持腎臟功能至關重要[23-24]。胃腸道干細胞具有分化為胃腸組織中幾乎所有的細胞的能力，對維持胃腸黏膜更新及保持組織內環境穩定起著至關緊要的作用[25]。神經干細胞來源于中樞神經系統，可以修復損傷的神經系統。以上干細胞均屬于成體干細胞，其來源之一為骨髓造血干細胞的分化。本實驗顯示，營養組合物可使AA大鼠的肝臟、腎臟、胃的干細胞標志物表達增加，但對AA大鼠的腸粘膜和神經干細胞標志物的表達無影響，說明營養組合物在一定程度上可促進AA大鼠肝臟、腎臟、胃干細胞的增殖，而對腸粘膜和神經干細胞的增殖無顯著差異作用。此過程中其潛在的可能機制為營養組合物可促進骨髓造血干細胞向肝、腎、胃干細胞的發育、增殖、分化，改善骨髓造血微環境或骨髓重建。◇