纖維蛋白原Bβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多態性與慢性阻塞性肺疾病急性加重期的相關性研究

慢性阻塞性肺疾病(COPD)為一種常見的慢性氣道性疾病，臨床上表現為進行性加重的呼吸困難，隨著疾病進展，可以并發呼吸衰竭、肺心病等，導致病人死亡，預計到2020年該病將會成為全球第三位主要的死亡原因和第五位主要的致殘原因[1-5]。研究表明，病人反復急性加重是疾病進展的主要危險因素，其發作頻率約為每年2.4～3次。目前針對預測COPD急性加重(AECOPD)的生物學標志物的研究多集中在血清炎癥因子，部分研究發現纖維蛋白原(Fg)水平在AECOPD病人中增高，分析可能與AECOPD病人血液黏稠度增高、存在炎癥導致病人血管內皮功能受損有關。但未見Fg基因多態性和AECOPD的相關性研究的報道。目前有研究表明，FgBβ鏈基因的10余個多態性位點中，FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A位點可能與血管內皮損傷有關[6-10]。

因此，本研究探討FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多態性與AECOPD的關系，為早期識別AECOPD高風險人群提供依據，以便臨床醫師早期干預。

1 對象和方法

1.1 研究對象 納入標準：根據中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組COPD診治指南(2013年修訂版)中關于COPD的定義[1]，選擇符合診斷標準的COPD病人80例作為病例組，同時選擇年齡、性別、吸煙史與之相匹配的健康體檢者100例作為對照組。根據上一年度急性加重次數劃分亞組，其中≥2次/年為急性加重亞組，<2次/年為非急性加重亞組。病例組男51例，女29例，年齡67～71歲，平均(69.17±2.87)歲，平均吸煙(5.91±3.12)年，對照組男68例，女32例，年齡66～72歲，平均(69.00±3.12)歲，平均吸煙(5.56±4.91)年。

排除標準：(1)合并嚴重肝腎疾病、惡性腫瘤及血液系統疾病病人；(2)合并嚴重心臟疾病及心律失常病人；(3)應用抗凝藥物病人。

1.2 研究方法 2組病人入組后均抽取清晨空腹靜脈血檢測Fg水平，同時抗凝管采血3 mL，低滲法分離白細胞后，應用酚/氯仿法提取DNA，應用多聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的DNA，限制性內切酶酶切擴增產物，將酶切產物在8%(質量濃度)非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，檢測FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多態性位點的基因型。比較2組病人Fg水平及兩個位點基因型分布頻率及等位基因分布頻率。

2 結果

2.1 FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因位點多態性電泳結果 PCR擴增FgBβ-249C/T基因T純合子(T/T)產物片段長度為311 bp；C純合子(C/C)產物片段長度為249 bp和62 bp；CT雜合子(C/T)產物片段長度為311 bp、249 bp和62 bp，因62 bp的片段分子量小，泳動速度較快，已經跑出膠外，因此圖中未顯示。PCR擴增FgBβ-854G/A基因A純合子(A/A)產物片段長度為114 bp；G純合子(G/G)產物片段長度為90 bp和24 bp；GA雜合子(G/A)產物片段長度為114 bp、90 bp和24 bp。因24 bp的片段分子量小，泳動速度較快，已經跑出膠外，因此圖中未顯示。見圖1，2。

2.2 2組血漿Fg水平比較 與對照組相比，病例組血漿Fg水平明顯增高[(275.81±49.99)mg/dL比(418.51± 154.00)mg/dL,t=7.959 ,P<0.05]。在病例組中，急性加重與非急性加重亞組比較，血漿Fg水平無明顯差異[(412.02±146.61)mg/dL比(431.26±169.76)mg/dL,t=0.5269 ,P=0.106]。

圖1 FgBβ-249C/T電泳結果

圖2 FgBβ-854G/A電泳結果

2.3 FgBβ-249及FgBβ-854基因多態類型及等位基因比較 病例組FgBβ-854 GA型突變率高于對照組(25.0%比4.0%，P<0.01)；病例組FgBβ-249 CT型突變率高于對照組CT型突變率(56.2%比27.0%，P<0.01)；FgBβ-854G/A及FgBβ-249C/T等位基因分布頻率在病例組及對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4 各亞組間FgBβ-249及FgBβ-854基因分布頻率及突變率比較 與非急性加重亞組比較，急性加重亞組FgBβ-854G/A基因型GG型、GA型、AA型分布頻率差異無統計學意義(P>0.05)；FgBβ-249C/T基因型CT型、TT型分布頻率差異存在統計學意義(P<0.01)。見表2。

3 討論

COPD臨床上表現為進行性加重的呼吸困難，病理生理上主要表現為進行性加重的氣流受限。隨著疾病進展，可以并發呼吸衰竭、肺心病等，導致病人死亡及殘疾，嚴重影響病人生活質量[1-4]。

表1 FgBβ-249及FgBβ-854基因型頻率及等位基因頻率比較

注：與對照組比較，**P<0.01

表2 急性加重與無急性加重亞組間FgBβ-249及FgBβ-854基因分布頻率及突變率比較(n,%)

注：與非急性加重亞組比較，**P<0.01

在之前研究中發現，Fgβ鏈基因的10余個多態性位點中，Bβ-249C/T和Bβ-854G/A位點可能分別與血管內皮損傷有關。血管內皮受損，一方面可以導致體內凝血異常，出現微小血栓形成，影響組織血供；另一方面，血管內皮損傷可以引起部分炎癥因子釋放[11-14]，引發體內炎癥反應。AECOPD病人由于肺部及全身炎癥反應，可以導致血管內皮損傷及凝血功能異常，導致體內高凝狀態形成。本研究發現，與對照組相比，病例組血漿Fg水平明顯增高，這與既往研究結果一致。但在病例組中，急性加重與非急性加重亞組比較，血漿Fg水平無明顯差異，分析該項結果可能與病人數量較少有關。下一步研究應進一步擴大研究病人數量。

FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A位點導致的血管內皮損傷進一步引發COPD病人體內炎癥反應及凝血異常，從而出現惡性循環。本研究發現，病例組FgBβ-854 GA型突變率高于對照組(25.0%比4.0%，P<0.05)；病例組FgBβ-249 CT型突變率高于對照組(56.2%比27.0%，P<0.05)；FgBβ-854G/A及FgBβ-249C/T等位基因分布頻率在病例組及對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。與非急性加重亞組比較，急性加重亞組FgBβ-249CT型、TT型分布頻率差異有統計學意義(P<0.01)。這提示FgBβ-249C/T位點突變率和AECOPD相關。

因此，針對COPD病人檢測FgBβ-249C/T位點突變率有助于預測AECOPD風險，有助于臨床醫生及早給予干預，減少病人急性加重次數，減輕病人因急性加重導致的肺功能下降及住院增加的經濟負擔，具有較好的應用前景。但本研究存在以下局限性：一方面本研究為回顧性研究，未進行前瞻性研究，需進一步明確FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因對于AECOPD風險的預測作用；另一方面，本研究入組人數偏少，有可能不能反映群體FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因分布情況。因此，下一步的研究中，需要進一步擴大樣本量，同時開展前瞻性研究，進一步探討FgBβ-249C/T和Bβ-854G/A基因多態性與AECOPD的相關性。