阿托伐他汀對(duì)2型糖尿病大鼠心肌GRP78和CHOP表達(dá)的影響

黃安靜，曾招軍，張春來，周洪霞，董云朋，遠(yuǎn) 迪

(1.華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市工人醫(yī)院心內(nèi)四科，河北 唐山 063000；3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病(diabetes mellitus，DM)引起的心肌結(jié)構(gòu)改變及功能異常[1]，已經(jīng)成為糖尿病患者死亡的主要原因之一，作為DM獨(dú)立的并發(fā)癥逐漸被臨床醫(yī)生所重視。Ding等[2]研究發(fā)現(xiàn)在尿毒癥小鼠心肌中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)標(biāo)志性蛋白GRP78及其誘導(dǎo)的凋亡途徑相關(guān)蛋白CHOP的表達(dá)明顯增加，在尿毒癥性心肌病的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用，但ERS在DCM的發(fā)病過程中誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前尚未明確。針對(duì)DCM，目前尚無特效的防治方案，因此找到有效的治療藥是非常重要的。近些年，他汀類藥物在治療心血管疾病方面的多效性備受關(guān)注，Xia等[3]研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀通過下調(diào)GRP78、CHOP的表達(dá)減少心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，起到防治心衰的作用，然而他汀類藥物是否能夠以此為靶點(diǎn)防治DCM尚未得到證實(shí)。該研究制備DCM大鼠模型，給予阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)，探討阿托伐他汀對(duì)2型糖尿病大鼠心肌的保護(hù)效應(yīng)及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 健康雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量(180±20)g，SPF級(jí)，6周齡，由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；血糖儀、血糖試紙(美國強(qiáng)生公司)；DAB試劑盒、Tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、ACTIN多克隆抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；CHOP單克隆抗體、GRP78多克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及建立模型 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為NC組、DCM組、DCM+Ato組，各12只。DCM組和DCM+Ato組采用高脂肪飼料喂養(yǎng)，NC組采用普通飼料喂養(yǎng)，4周后，禁食不禁水12 h，DCM組和DCM+Ato組大鼠一次性腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)2.5 mg/100 g(pH=4.5)，NC組注射等劑量的檸檬酸緩沖液，分別于第3、14天測大鼠空腹血糖(FBG)，連續(xù)兩次FBG≥16.7 mmol/L，確定為2型糖尿病模型。DCM+Ato組大鼠給予阿托伐他汀1 mg /(100 g·d-1)，對(duì)照組和DCM組給予等量生理鹽水，灌胃8周。實(shí)驗(yàn)?zāi)y各組大鼠FBG≥16.7 mmol/L，同時(shí)DCM組和DCM+Ato組經(jīng)左室插管評(píng)估心功能，心功能改變較NC組大鼠有意義的確定為2型DCM大鼠模型，實(shí)驗(yàn)?zāi)┕?3只大鼠(NC組12只，DCM組10只，DCM+Ato組11只)納入實(shí)驗(yàn)，3只可能由于感染或酮癥酸中毒死亡后予以剔除。

1.2.2 心功能檢測 至灌胃8周末，對(duì)納入實(shí)驗(yàn)的大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(3 mL/kg)使其麻醉，行氣管插管安裝呼吸機(jī)，將動(dòng)脈導(dǎo)管經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈逆行送入左室，穩(wěn)定數(shù)分鐘以后，測定LVEDP、LVSP和LV±dp/dtmax。

1.2.3 HE染色 將各組大鼠處死，取心臟組織用4%中性甲醛充分固定后，制作石蠟切片，行HE常規(guī)染色。光鏡下觀察心肌病理損害。

1.2.4 TUNEL檢測 TUNEL法測定心肌細(xì)胞凋亡，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用蛋白酶K室溫孵育15～30 min，滴加50 μL的TUNEL反應(yīng)混合溶液37 ℃孵育60 min，加入50 μL轉(zhuǎn)化劑-POD 37 ℃孵育30 min，加入DAB底物溶液顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，封片，在光鏡下進(jìn)行圖像分析。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比，得出凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.2.5 Western blot 取心肌組織提取蛋白，測定濃度，進(jìn)行SDS-PACE電泳分離蛋白，將目的條帶用電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉后分別孵育一抗GRP78(1∶500稀釋)和CHOP(1∶500稀釋)，4 ℃過夜，室溫孵育二抗(1∶3000稀釋)，顯影，以ACTIN作為內(nèi)參照，用自動(dòng)圖像分析軟件Image J進(jìn)行半定量分析。每個(gè)蛋白重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間的兩兩比較采用Scheffe檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心功能檢測結(jié)果 心功能指標(biāo)中LVSP、LV+dp/dtmax反映心臟的收縮功能，LVEDP、LV-dp/dtmax反映心臟的舒張功能。結(jié)果顯示：與NC組比較，DCM組大鼠LVEDP明顯升高，LVSP和LV±dp/dtmax明顯降低(P<0.05)；經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)后，與DCM組比較，DCM+Ato組大鼠LVEDP明顯降低，LVSP和LV±dp/dtmax明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)的檢測結(jié)果(x±s )

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)的檢測結(jié)果(x±s )

組別nLVSP/mmHgLVEDP/mmHgLV+dp/dtmax/(mmHg·s-1)LV-dp/dtmax/(mmHg·s-1)NC組12140.81±9.433.93±0.494032.12±160.083877.88±175.32DCM組10107.21±10.121)10.11±0.851)2429.40±246.681)2035.90±268.741)DCM+Ato組11122.64±7.851,2)7.05±0.831,2)3259.36±177.631,2)2846.19±210.981,2)F值33.72177.50166.57171.73P值0.0000.0000.0000.000

注：1)與NC組比較P<0.05；2)與DCM組比較P<0.05

2.2 心肌組織病理學(xué)改變 HE染色顯示：NC組心肌纖維排列整齊、致密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核大小均一；DCM組心肌纖維排列紊亂、稀疏，出現(xiàn)斷裂，心肌細(xì)胞肥大變性，細(xì)胞核大小不一，細(xì)胞間質(zhì)變寬，滿視野見炎性細(xì)胞；DCM+Ato組有類似DCM組大鼠心肌病理學(xué)改變，但程度顯著減輕。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 TUNEL染色顯示：正常心肌細(xì)胞的胞核呈藍(lán)色，凋亡心肌細(xì)胞的胞核呈棕黃色。NC組可見少量凋亡心肌細(xì)胞，DCM組較NC組凋亡心肌細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，DCM+Ato組較DCM組凋亡心肌細(xì)胞明顯降低(P<0.05)，但仍高于NC組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織細(xì)胞AI、GRP78、CHOP定量表達(dá)比較

注：1)與NC組比較P<0.05；2)與DCM組比較P<0.05

2.4 心肌組織的GRP78和CHOP蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測顯示：與NC組比較，DCM組大鼠心肌組織GRP78和CHOP表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與DCM組比較，DCM+Ato組大鼠心肌組織GRP78和CHOP表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

3 討 論

DCM的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜和多因素的，雖然對(duì)DCM分子病因的研究已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但人們對(duì)此仍然知之甚少。糖尿病患者體內(nèi)的脂毒性、炎癥因子增加、氧化應(yīng)激等因素，可以使心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白或者錯(cuò)誤折疊蛋白堆積，誘發(fā)ERS產(chǎn)生[4]。GRP78屬于HSP70家族，是ERS過程中最重要的分子伴侶，靈敏地監(jiān)測著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白的折疊加工情況，隨時(shí)進(jìn)行修正，當(dāng)ERS被激發(fā)時(shí)，其表達(dá)量顯著增加，被認(rèn)為是ERS的標(biāo)志性蛋白[5]。在嚴(yán)重或持續(xù)應(yīng)激狀態(tài)下，GRP78表達(dá)的上調(diào)不能夠維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)時(shí)，一種ERS特異的凋亡轉(zhuǎn)錄因子——CHOP便被激活。CHOP又名生長抑制和DNA損傷153，ERS上游的IRE1、PERK、ATF6這3條信號(hào)傳導(dǎo)通路，都能夠激活CHOP基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)疾病進(jìn)展[6]。Fu等[7]在主動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致的心力衰竭小鼠模型中證實(shí)了CHOP基因缺失的細(xì)胞可以抵抗ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說明在ERS過程中CHOP介導(dǎo)的凋亡通路起到非常重要的作用。心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失，參與心肌重構(gòu)，是心肌病發(fā)生發(fā)展的重要致病因素[8]。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了缺血再灌注大鼠的心肌損傷，通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可以減輕心室重構(gòu)，改善心臟收縮功能。

他汀類藥物在治療心血管疾病方面有許多調(diào)節(jié)血脂以外的作用，Burma等[10]報(bào)道瑞舒伐他汀可以通過抗炎、抗氧化作用減輕心肌缺血再灌注大鼠的心肌損傷，還有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以通過改善血管內(nèi)皮功能障礙發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[11]。近年來對(duì)他汀類藥物的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其可以通過減少心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心血管保護(hù)作用[12-14]。心肌細(xì)胞凋亡也參與了糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展[15]，阿托伐他汀是否能抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮防治糖尿病心肌病的作用目前少有報(bào)道。

本研究采用HFD聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方法制作DCM大鼠模型[16]，給予阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)。與NC組相比，DCM組大鼠心肌病理損傷顯著，LVEDP明顯升高，LVSP和LV±dp/dtmax明顯降低，提示大鼠心功能降低，表明DCM大鼠模型制備成功；且DCM組大鼠心肌內(nèi)GRP78、CHOP表達(dá)明顯增多，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，提示DCM大鼠心肌中存在ERS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。與DCM組相比，DCM+Ato組大鼠心肌病理損傷明顯減輕，GRP78、CHOP表達(dá)明顯減少，心肌細(xì)胞AI明顯下降，LVEDP明顯降低，LVSP和LV±dp/dtmax明顯升高，提示阿托伐他汀能明顯減輕DCM大鼠心肌組織病理學(xué)損傷及抑制DCM大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，從而有效改善心臟功能紊亂，且這種對(duì)于DCM大鼠的心臟保護(hù)作用可能與下調(diào)GRP78、CHOP的表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在DCM的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，阿托伐他汀通過抑制ERS中CHOP相關(guān)凋亡通路產(chǎn)生心臟保護(hù)作用，改善心功能，為臨床治療糖尿病心肌病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而DCM的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，因此，深入研究他汀類藥物的心臟保護(hù)機(jī)制，將對(duì)DCM的防治有著重大意義。