新疆維吾爾族局部晚期或晚期食管癌放化療療效相關蛋白及KEGG通路的分析

楊媚 羅威 馬曉麗

【摘 要】目的：分析維吾爾族局部晚期或晚期食管癌患者的血清差異蛋白相關通路。方法：收集維吾爾族食管鱗癌患者28例，采集維吾爾族食管癌患者接受放化療前后的靜脈血，對食管癌與健康對照組進行差異蛋白篩選并導入KEGG數據庫，進行進一步分析。結果：放化療后近期療效無效組與近期療效有效組比對，共篩選出52個差異蛋白；放化療后PFS大于1年組與小于1年組比對，共篩選出128個差異蛋白；近期療效行KEGG通路分析中，共篩選出4個有統計學差異通路；遠期療效PFS大于1年組與PFS小于1年組比對差異蛋白導入KEGG數據庫，有統計學差異的KEGG通路有1個。結論：在KEGG通路分析中，維吾爾族食管癌患者在治療前后均觀察到，KEGG通路TLR、NF-kB信號通路有相似的差異蛋白參與，均提示預后不良，可以作為今后研究重點。

【關鍵詞】食管癌；民族；蛋白；信號通路

【中圖分類號】R735.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）08--01

新疆部分高發腫瘤疾病呈現地域性分布，如南疆范圍內以宮頸癌為主，北疆范圍內以食管癌為主。維吾爾族是新疆主要的少數名族，人口約占全區的一半以上。且王振家等[1]報道在哈密地區維吾爾族惡性腫瘤分布中，食管癌排在了第1位，而且維吾爾族惡性腫瘤的總發病率高于漢族、哈薩克族。在人體血液循環中有大量的小分子量（low molecular weight，LMW）蛋白。這些小分子量蛋白蘊含的信息能用于早期診斷、鑒別診斷、療效評估和預后判斷[2]。腫瘤患者的體液中如血清或血漿就是可靠的標記物來源[3]。理想的蛋白標記物應具有很高的特異性和敏感性，所應用的技術可靠、快速和經濟；標本中含有的標記物容易獲得。因此，我們將對維吾爾族局部晚期食管癌患者的療效相關的血清差異蛋白進行篩選并進一步行KEGG通路分析，試圖發現具有預測放化療療效價值的分子標記物。

1 材料與方法

1.1 材料收集

收集新疆醫科大學第一附屬醫院2014年06月-2015年06月收治的臨床分期為III-IVA期的維吾爾族食管鱗癌患者28例。采集接受放化療前食管鱗癌患者外周靜脈血5ml，所有食管癌患者完成同期放化療后，按照隨訪時間長短再次采集靜脈血5ml。所有病例均經胃鏡活檢，組織病理確診為鱗狀細胞癌，分期為III-IVA期食管癌患者，一般狀況（PS）評分≤2分。所有患者預計生存期≥6個月，無主要器官功能障礙，心、肺、肝、腎功能基本正常。

同期放化療方案：化療方案：FP方案：5-FU （氟尿嘧啶）（750-1000mg/m2）+DDP（順鉑）（75-100mg/m2），3-4周一次。所有的患者先行同步放化療，放療結束后然再序貫化療，直至完成共4-6周期化療。如近期療效評價為有效，繼續原化療方案。如評價為無效，則改用TP方案：紫杉醇（135-150mg /m2） /多西他賽（75mg/m2） +卡鉑（AUC5-6） /順鉑（75mg/m2）。放療方案：三維適形放療或調強放療，DT50-60Gy/2Gy /25-30f。

1.2 方法

采用同位素標記相對和絕對定量技術（iTRAQ），該技術通過蛋白質提取、消化，利用多種同位素試劑標記蛋白多肽，然后用高精度質譜儀串聯分析，篩選綜合治療前后食管癌患者血清蛋白質譜表達差異。將差異蛋白導入KEGG的Pathway數據庫，分析差異表達蛋白質的相關的代謝通路。

1.3 血清差異蛋白的篩選標準

按對比要求進行組間比較，組間比值大于1.2（表達上調）或小于0.833（表達下調），P<0.05為差異蛋白的篩選標準。其中組間比值大于1.5為顯著表達上調，組間比值小于0.6為顯著表達下調，對篩選的差異蛋白進一步在http：//www.uniprot.org進行驗證。

2 結果

2.1 放化療后食管癌患者近期療效差異蛋白篩選

對完成放化療后的患者進行隨訪評價，結果顯示：近期療效有效的食管癌患者有15人，其中完全緩解的有1人，部分緩解的有14人；近期療效無效的食管癌患者有13人，其中穩定的有8人，進展的有5人，客觀有效率為53.6%。共篩選出52個差異蛋白，上調蛋白有29個，下調蛋白有23個，其中顯著表達上調的蛋白有角蛋白10（K10）、角蛋白2（K2）等，顯著表達下調的蛋白有組蛋白H4（H4）、組蛋白H2B等。

2.2 放化療后食管癌患者PFS大于1年與小于1年差異蛋白篩選

PFS大于1年組的食管癌患者有16人，PFS小于1年組的食管癌患者有12人，其中有5人在1年內死亡，7人在1年內進展。共篩選出128個差異蛋白，上調蛋白有73個，下調蛋白有55個。其中顯著表達上調的蛋白有cDNA FLJ93312（B2R773）、REV25-2（A0N7J6）等，顯著表達下調的蛋白有免疫球蛋白重鏈可變區1-18（IGHV1-18）等

2.3 近期療效血清差異蛋白相關通路分析

52個局部晚期或晚期維吾爾族食管鱗癌放化療后近期療效組的差異蛋白被導入KEGG數據庫后，將不同的蛋白質富集到共同代謝途徑中，共得到104個差異蛋白的KEGG通路，有統計學差異的KEGG通路有4個（P<0.05），沒有與腫瘤有相關性的通路（表1）。

2.4 局部晚期或晚期維吾爾族食管鱗癌患者PFS大于1年組與PFS小于1年組比對差異血清蛋白相關通路分析

128個局部晚期或晚期維吾爾族食管鱗癌放化療后遠期療效PFS大于1年組與PFS小于1年組比對差異蛋白被導入KEGG數據庫后，將不同的蛋白質富集到共同代謝途徑中，共得到127個差異蛋白的KEGG通路，有統計學差異的KEGG通路有1個（P<0.05），與腫瘤有相關性的通路有1個（表2）。

3 討論

由于食管癌缺乏特異性的分子通路機制的結果，使得個體化治療仍處于盲區。若能在治療前根據食管癌患者分子蛋白情況，預知化療方案的敏感度，精準制定符合患者個體差異的有效方案，就可使患者獲得收益大而毒副作用小的的效果。本研究通過采用iTRAQ最新蛋白定量技術，收集了維吾爾族食管鱗癌患者28例，通過治療后近期療效好壞、PFS生存時間長短進行分組對比，并將顯著差異蛋白導入KRGG數據庫進行通路分析，試述如下：

局部晚期或晚期維吾爾族食管鱗癌近期療效行KEGG通路分析中，將52個差異蛋白導入KEGG數據庫，共得到104個差異蛋白的KEGG通路，我們選擇P<0.05有統計學差異的信號通路，共篩選出4個，卻無腫瘤相關通路。發現近期療效中組蛋白H2B下調參與TLR通路（P=0.28），而該通路的激活直接影響腫瘤微環境，促進腫瘤生長，這與近期療效無效提供一個很好的解釋，進一步驗證了此通路有促進癌癥發展的結論，可作為今后研究的重點。

我們同樣將128個遠期療效PFS大于1年組與PFS小于1年組比對差異蛋白導入KEGG數據庫，將不同的蛋白質富集到共同代謝途徑中，共得到127個差異蛋白的KEGG通路，有統計學差異的KEGG通路有1個（P<0.05），PPAR信號通路為腫瘤相關通路。

過氧化物酶體增殖物激活型受體（peroxisome proliferator activated-receptors，PPARs）是一類由配體激活的核轉錄因子，屬于受體超家族成員。曾有學者[4]已經證實胰腺癌中PPARα水平明顯高于腫瘤臨近組織，PPARα表達水平與腫瘤患者高的生存率呈負相關。而Wu K[5]在食管癌方面的研究中發現，PPARg的激活抑制了tlr4依賴性MAPK通路，抑制了食管癌細胞的增殖并且誘導食管癌腫瘤細胞凋亡，本部分研究中PFS>1年組與PFS<1年組的差異蛋白載脂蛋白（a、A-II、A-I、C-III、A-IV）、cDNA，FLJ93312參與該通路的調控，與Wu K既往研究一致，促進了食管癌的凋亡，有較好的預后。雖然在治療前后均有此通路參與，但P>0.05，考慮經過一段時間放化療，PPAR信號通路進一步激活起到抑制腫瘤作用，使患者獲得比較長的生存時間。

除此之外，信號通路NF-kB在此療效對比中同樣有差異蛋白脂多糖、cDNA FLJ75416參與，活化的NF-kB轉位到核內與其相關的DNA基序結合可以誘導靶基因的轉錄。包括多種病原的組分例如脂多糖，前炎性細胞因子等在內的多種信號可活化這種途徑。脂多糖與腫瘤促進有一定相關，此蛋白下調是否可下調NF-kB通路的表達，使患者有較好的預后，我們需要進一步沉默或激活靶基因進行證實。

通過KEGG通路分析差異蛋白參與的信號通路，進一步驗證了差異表達的血清蛋白的功能，為今后差異蛋白的靶基因的研究奠定了基礎。由于食管癌分子蛋白可以參加數百種通路，且通路之間影響也有相互交叉，且無統計學差異的通路也并非真正意義上無效果的通路，故特異性通路需要更多的有質量的實驗來探索及驗證。

總而言之，此部分內容分別分析了維吾爾族近期療效、遠期療效相關的差異顯著蛋白相關的信號通路。在KEGG通路分析中，維吾爾族食管癌患者在治療前后均觀察到，KEGG通路TLR、NF-kB信號通路有相似的差異蛋白參與，均提示預后不良，可以作為今后研究重點。

參考文獻

王振家， 李霞， 高凡， 等.新疆哈密地區2010～2012年惡性腫瘤發病分析[J].新疆醫學，2015，45（10）：1501-1504.

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Wu K， Yang Y， Liu D， et al.Activation of PPARγ suppresses proliferation and induces apoptosis of esophageal cancer cells by inhibiting TLR4-dependent MAPK pathway[J].Oncotarget.2016Jul12；7（28）：44572-44582.