冬蟲夏草聯合丹參器官保存液對大鼠肝臟保存效果的研究

趙鵬偉 ，黃建釗 ，李瑋 ，劉雋 ，張佳偉 ，柳嚴 ，劉江偉

1.貴州省人民醫院肝膽外科，貴州貴陽 550002；2.貴州省貴陽市貴陽中醫學院，貴州貴陽 550002

臨床上以肝臟移植最為常見，且肝臟移植的成功率呈逐年增加的趨勢，延長了肝病患者的壽命[1]。對于肝臟移植最為關鍵的一步就是如何更好的保存、獲取高質量的移植器官，一般來說，如果常溫下對肝器官不實施任何針對性保護，短期內會導致其功能降低或壞死，為了解決這一難題，器官保存液越來越多的被應用到器官移植中，使離體器官在離體環境中也能保持較好的完整性和活性，提高了器官移植的成功率，促進了器官移植的發展，但不同的器官保存液的保存效果和應用價值也是不同的，如何選取保存液使器官的保存效果達到最優，仍需要不斷的研究[2]。該文以2016年3月—2017年3月該院進行肝臟移植試驗的86只SD大鼠為實驗對象，分析研究冬蟲夏草聯合丹參器官保存液對大鼠肝臟保存效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院進行肝臟移植試驗的86只SD大鼠作為該次研究對象，隨機數字表達法分為43例研究組和43例對照組。其中，對照組中雄性大鼠26只，雌性大鼠 17 只，體重為 240～289 g，平均體重為（264.2±0.3）g；研究組中雄性大鼠23只，雌性大鼠20只，體重為 245～300 g，平均體重為（272.3±0.2）g。 兩組大鼠均已達到健康和清潔標準，且在體重、周齡等方面比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 對照組制作方法 對照組中采用UW保存液對大鼠肝臟進行保存。并構建SD大鼠非循環離體灌注模型[3]。具體制作如下：對于需要移植的供體和受體，手術前8 h禁食不禁水，對大鼠進行麻醉，麻醉后在大鼠背部加墊，使其呈仰臥位，在大鼠腹部正中位置行十字切口，開腹，用血管鉗固定腹腔，切斷并清除掉肝臟周圍暴露出的血管，結扎左隔下靜脈，并將二者離斷；按壓腸管，使其向大鼠左下腹傾斜，分離并切斷肝臟周圍的韌帶，然后結扎血管，將手術刀順時針旋轉，注意避免肝臟周圍組織受損，使肝臟充分游離，同時游離肝上肝下腔靜脈、門靜脈和膽總管等。從肝下下腔靜脈注入2 mL肝素鈉液 (肝素鈉125 μ/mL)使SD大鼠全身肝素化[4]。在距離肝門1cm的位置切開膽管前壁，用插入硬膜外導管的方式固定膽管；從門靜脈置管原位灌注冬蟲夏草聯合丹參器官保存液和4℃的UW液，以3 mL/min的流速經肝臟原位灌注30 min，阻斷肝上肝下腔靜脈，為開辟一輸出道使灌出液輸出，在肝下下腔靜脈前壁切開一小口，等到肝臟完全變為土黃色，切斷各血管并結扎肝上下靜脈，再將肝臟取出，放入保存液中保存，設定保存液保存溫度為4℃。兩組實驗在保存結束后經門靜脈留置管以8 mL/min的灌注量再灌注恒溫37℃的乳酸鈉林溶液30 min。離體結束后，檢測兩組大鼠的膽汁分泌量以及保存液的pH值和滲透壓，觀察兩組保存液的保存效果以及移植后器官的存活率。

1.2.2 研究組制作方法 研究組中采用冬蟲夏草聯合丹參器官保存液對大鼠肝臟進行保存，具體制作過程如下：①取得100 g丹參，加入8倍量的水，在浸泡2.5 h后煎煮1.5 h，過濾渣后重復以上操作2次，每次1 h，濾過合并濾液，濾液濃縮后至1 L，備用。②首先將8 g新鮮秘制的蟲草干粉樣品倒入蒸餾水中，在30℃的恒溫條件下浸泡3 h，12 000 r/min離心15 min，得到液體A，把剩下的藥渣放入250 mL的玻璃容器中，再加入150 mL的蒸餾水并在56℃的水浴中進行4 h的回流，經冷卻并采用簡單的過濾，除去藥渣后經0.45 μm混合纖維素酯膜濾器過濾除菌得到液體B。混合兩種液體配置成250 mL冬蟲夏草液[5]。制成后，按照國際標準器官保存液準則在干燥清潔的條件下配置冬蟲夏草聯合丹參器官保存液，并于在室溫為20～24℃按1 000 mL的量配置。制作大鼠離體灌注模模型同上。

1.3 觀察標準

測定兩組保存液的膠體滲透壓和pH值；對大鼠進行立體灌注后，通過膽管置管采集各肝臟標本再灌注30 min內分泌的膽汁，用手動分液器測量分泌的膽汁量，并做好相關記錄。

1.4 統計方法

數據應用SPSS 18.0統計學軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，行t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

研究組與對照組中的兩種保存液其pH值和滲透壓值相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩種保存液的pH值和滲透壓值對比（±s）

表1 兩種保存液的pH值和滲透壓值對比（±s）

m o l/L）1 0.9 5 1 1.0 3 1 5

研究組中的離體大鼠隨著時間的延長所分泌的膽汁量越少，且膽汁的分泌量明顯少于對照組中的大鼠（P＜0.05）。 見表 2。

表2 兩組離體SD大鼠肝臟保存不同時間后再灌注膽汁分泌量[（±s），μL]

表2 兩組離體SD大鼠肝臟保存不同時間后再灌注膽汁分泌量[（±s），μL]

組別4 h 8 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h對照組（n=4 3）研究組（n=4 3）t值P值1.6 7±0.0 3 1.9 7±0.1 2 1 3.2 9 4＜0.0 5 2.3 4±0.2 1 2.2 3±0.1 3 1 3.3 9 1＜0.0 5 2.7 5±0.1 1 2.6 7±0.2 1 1 5.1 2 5＜0.0 5 3.0 1±0.0 4 2.8 6±0.0 9 1 7.9 3 5＜0.0 5 3.2 8±0.5 6 3.1 7±0.0 9 1 5.6 9 3＜0.0 5

3 討論

器官保存液的出現極大的促進了臨床醫學器官移植手術的發展和推廣，UW液是目前國內比較常用的器官保存液，保存時間較長，且大大提高了離體器官的質量，為器官的移植和移植后的成功率做出了很大的貢獻[6]。該文充分利用中藥資源，根據冬蟲夏草和丹參的藥理性質，配置成冬蟲夏草聯合丹參器官保存液，以健康的SD大鼠作為實驗對象，對比分析了冬蟲夏草聯合丹參器官保存液和UW液對大鼠肝臟的保存效果，監測兩種保存液的PH值和滲透壓以及兩組大鼠所分泌的膽汁量，從而得出相應的結論[7]。

該次研究中所有的離體活體實驗都在保存液配置成功后一周內進行，研究表明應用冬蟲夏草聯合丹參器官保存液經過一周的監測后其指標與UW液并無明顯差異，有一定的緩沖能力，有效防止酸中毒：雖然肝臟在離體后會流失一定的血量，但是其細胞內的代謝并未停止，許多代謝產物的累積使氫離子的濃度升高，從而保存液的pH值會發生變化，臨床器官移植上保存液pH值與器官細胞pH值密切相關，保存液pH值的變化能進一步反映出肝細胞pH值的變化。通常來說，使肝細胞能發揮較好的功能，必須要將肝細胞的pH值穩定在7.5左右，因此保持器官保存液的緩沖能力對防止酸中毒起到非常重要的作用[8]。結果顯示，所配置的冬蟲夏草聯合丹參器官保存液與UW液相比pH值無顯著差異，研究組中保存液的pH值和滲透壓分別為（7.41±0.56）和（325.09±11.03）mmol/L，與對照組中UW保存液的pH值和滲透壓相比差異無統計學意義，證實了其具有強大的緩沖能力，能有效防止酸中毒，隨著保存時間的延長，兩組大鼠肝臟器官膽汁分泌量逐漸減少，且短期內研究組膽汁分泌量與較相同時期的對照組相比，分泌量差異有統計學意義，隨著時間的不斷延長，研究組膽汁分泌量比對照組研究組膽汁分泌量要更少一些，進一步說明冬蟲夏草聯合丹參器官保存液對肝臟器官的保護作用更好一些，有效防止組織壞死[10]。張佳偉等人[9]采用大鼠模型(IPRL)，加入不同劑量冬蟲夏草，記錄膽汁流出量，結果提示冬蟲夏草組的膽汁分泌(172.95±12.7)μL 明顯高于對照組(98.68±5.5)μL(P＜O.01)，門冬氨酸轉氨酶(AST)(38.87±12.66)U/L明顯低于保存對照組 (145.I2±8I.56)U/L[9]。

有個別研究中去掉了UW液中的青霉素、胰島素等成分后無明顯影響，該次研究中研制的新型保存液改用色氨酸，最終能生成ATP，為缺血細胞再灌注能量，防止了細胞再灌注遭受損傷，促進了細胞的新陳代謝。此外，該項實驗所建立的SD大鼠非循環離體灌注模型便于觀察，簡單且容易操作，有利于實驗的順利進行[10]。為保護細胞結構不受損壞，冬蟲夏草聯合丹參器官保存液中應用高鎂抑制細胞內的鈣超載,防止器官缺血損傷,利于促進器官功能的恢復。加入冬蟲夏草和丹參能起到拮抗氧自由基、抗氧化、和缺血再灌注損傷的作用，二者相結合有利于促進對細胞膜的完整性保護[11]。此外，該次實驗的過程中，應檢查靜脈切口是否過大，是否與靜脈套管接口吻合；實驗時根據大鼠體重予以麻醉劑量；取出肝臟時注意防止出血；注意對大鼠的保暖等[12]。

綜上所述，就對離體SD大鼠肝臟的保存效果來看，研制的冬蟲夏草聯合丹參器官保存液與UW液保存效果相近，在灌注后肝細胞膽汁分泌方面略優于UW液，冬蟲夏草聯合丹參器官保存液對SD大鼠肝臟的保存效果較好，在臨床上值得進一步推廣。