細胞核相關抗原（Ki67）和p53表達對非小細胞肺癌患者預后的意義*

張衛東，江剛，吳懷球，喻宏，劉志光

（湖南省人民醫院 1.呼吸內科，2.病理科，湖南 長沙 410005）

肺癌是我國發病率和致死率較高的一類癌癥，很多患者一旦發現已進入中晚期，直接影響肺癌的治療及預后[1]。非小細胞肺癌約占所有肺癌的85%，約75%的非小細胞肺癌患者發現時已處于中晚期，5年生存率很低。非小細胞肺癌的發生、發展是一個多基因調控的復雜過程，腫瘤細胞凋亡障礙以及腫瘤細胞增殖活性增強都是導致肺癌發生、發展的重要原因，也是肺癌惡性生物學行為及不良預后的元兇[2-3]。因此對腫瘤細胞增殖活性檢測對判斷腫瘤惡性程度以及預后評估有重要意義[4-5]。

細胞核相關抗原Ki67（nuclear-associated antigen ki-67, Ki67）是一種大分子蛋白質，是檢測細胞增殖活性的常用指標，對部分實體瘤來說，例如乳腺癌，Ki67指數與患者預后呈負相關，Ki67指數越高，說明腫瘤惡性程度越高，患者往往分期較晚，腫瘤負荷較大。但有時Ki67越高，化療效果越好，因為處于分裂期的細胞對化療藥物較敏感[6-7]。有研究認為Ki67不能作為獨立判斷預后的指標，需綜合其他指標評估預后[8]。p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，作為一個轉錄因子，可以阻滯細胞周期，促進細胞凋亡，同時可以維持基因組穩定，抑制腫瘤血管生成，從而防止癌變。p53基因的失活對腫瘤的形成起著重要作用[8-9]。但也有學者認為，p53也不能作為獨立判斷預后的指標[10]。有報道稱，在肺癌組織中，Ki67與p53表達有一定相關性。有分析發現Ki67與p53表達呈正相關，同時研究表明，p53是影響Ki67表達的主要因素[7，11-12]。突變型p53表達可能促進或激活Ki67表達，抑制肺癌細胞凋亡，加速細胞增殖。有文獻報道，Ki67與p53表達呈負相關[13]。對相悖的結論，尚需大量臨床數據以及相關研究進一步證實。本研究的目的是利用半定量的方法探討Ki67和p53聯合檢測與非小細胞肺癌患者生存率之間的關系，為非小細胞肺癌診斷及預后判斷提供輔助依據。

1 資料與方法

1.1 基本資料

本研究為回顧性研究，收集2006年12月-2011年12月某醫院非小細胞肺癌患者157例，其中符合診斷與納入標準的患者96例。平均（55.60±8.69）歲；男性72例，平均（56.90±8.22）歲；女性24例，平均（54.70±7.88）歲。

1.2 診斷與納入標準

①全肺根治性切除術并在本院有石蠟樣本；②臨床病理診斷為非小細胞肺癌；③有完整詳細的臨床隨訪資料和病理診斷資料；④術前未接受靶向藥物等治療；⑤患者死亡原因均為肺癌所致；⑥隨訪可以獲得患者目前存活信息。

1.3 免疫組織化學檢測

免疫組織化學（簡稱免疫組化）染色采用SP法[14]。Ki67和p53抗體均購自Santa公司。用于定性觀察和拍照的白片用蘇木素復染，用于定量測試的白片不復染。梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照片為已知肺癌陽性的組織，陰性對照片為PBS代替一抗。

1.4 免疫組化結果判定及Ki67和p53半定量判定

1.4.1 免疫組化結果半定量判定 在確定免疫組化染色無誤的條件下，以細胞核染色呈棕黃色或棕褐色為陽性。染色程度分為3級：0級，基本不著色；1級：著色淡黃色；2級：著色呈黃色；3級，著色呈棕黃色。染色陽性細胞百分比分為5個等級：0級≤5%，5%＜1級≤25%，25%＜2級≤50%，50%＜3級≤75%，4級＞75%。陽性高表達：染色程度*陽性細胞百分比≥4，余陰性。

1.4.2 分組 根據半定量結果，分組如下：A組（Ki67高表達，p53高表達）；B組（Ki67高表達，p53低表達）；C組（Ki67低表達，p53高表達）；D組（Ki67低表達，p53低表達）。A組納入23例，其中腺癌14例，鱗癌6例，腺鱗癌2例，大細胞癌1例；B組22例，其中腺癌12例，鱗癌5例，腺鱗癌3例，大細胞癌2例；C組23例，其中腺癌14例，鱗癌7例，腺鱗癌1例，大細胞癌1例；D組28例，其中腺癌15例，鱗癌10例，腺鱗癌2例，大細胞癌1例。見圖1。

1.5 統計學方法

圖1 各組HE染色及免疫組化結果

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件，計數資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，生存率組間比較采用K-M生存曲線法及Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ki67、p53陽性細胞率與非小細胞肺癌患者生存時間的相關性

Ki67陽性細胞率（33.62±12.16）%與非小細胞肺癌患者生存時間（35.32±23.79）個月，雖然差異有統計學意義（P=0.030），但兩者的相關性較弱（r=-0.200）；p53陽性細胞率（22.53±25.67）% 與非小細胞肺癌患者生存時間無相關性（r=0.003，P=0.050）。

2.2 非小細胞肺癌患者對生存期影響的單因素分析

結果顯示，Ki67和p53共表達以及原發腫瘤局部淋巴結遠處轉移（tumor lymbp node metastasis,TNM）分期對患者生存期有影響，差異有統計學意義（P＜0.05），性別、年齡、非小細胞肺癌組織學分型以及吸煙與否等因素對患者生存期均無影響，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

4組生存時間，差異有統計學意義（χ2=8.330，P=0.000）。D組即Ki67和p53均低表達時，中位生存時間及1～5年生存率均高于其他3組。見表2和圖2。

TNM分期如下，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者分別為26、30和40例，中位生存時間分別為62、44和20個月，且生存時間，差異有統計學意義（P=0.000）。見圖3。腺癌、鱗癌、腺鱗癌和大細胞癌4種組織學分型生存時間，差異無統計學意義（P=0.750）。見圖4。

表1 單因素分析不同臨床和病理狀況下對生存期影響

表2 4組非小細胞肺癌患者生存期比較

2.3 預后影響因素的Cox回歸分析

本研究將性別、吸煙史、肺塵史、組織學分型、分化程度、TNM分期、Ki67表達、p53表達以及Ki67與p53共表達納入Cox回歸分析，以α=0.05（雙側）為標準，P＜0.05為差異有統計學意義，結果提示，影響生存時間的因素為TNM分期（P=0.006），TNM分期越大，死亡風險越高。見表3。

圖3 TNM分期的生存曲線

圖4 肺癌不同組織學分型的生存曲線

表3 預后影響因素的Cox回歸分析

3 討論

流行病學調查表明，肺癌的控制已經成為全世界關注的重點問題。其中非小細胞肺癌是肺癌中最常見的一種類型，盡管傳統的開放式手術、胸腔鏡手術、化放療等規范式治療以及分子靶向藥物治療等個體化治療挽救了許多非小細胞肺癌患者的生命，但非小細胞肺癌患者5年生存率無法提升依舊是難以攻克的難題[11，15]。肺癌發病率和死亡率居高不下的原因仍不是很清楚，目前認為肺癌侵襲轉移、易感人群的基因異常以及肺癌細胞的多藥耐藥等是部分原因[1，16-18]。在發病率和死亡率居高不下的情況下，如何用更好的方式和敏感的指標去評估非小細胞肺癌患者尤其是術后患者的預后及影響因素，并希望盡早予以干預，成為亟待解決的問題。

目前肺癌的腫瘤標志物包括細胞角蛋白19片段（cytokeratin-19-fragment, CYFRA21-1）、 癌 胚 抗原（carcino-embryonic antigen, CEA）、特異性神經元烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）、糖類抗原CA-125和鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen, SCC）等，可以用于治療檢測以及預后的評判。然而單一血清腫瘤標志物在檢測非小細胞肺癌中的敏感性以及特異性等方面都難以達到理想水平。也有文獻報道認為基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）（MMP-2、MMP-9）、轉化生長因子（transforming growth factor, TGF）等生物學因素也與非小細胞肺癌預后相關[19]。Wu等報道稱年齡、組織學分型、轉移部位（肝和肺）、治療方式（靶向治療和放射治療）、淋巴細胞率等與非小細胞肺癌患者總體生存率獨立相關[20]。HOOD和PARADA等[21-22]提出，非小細胞肺癌吸煙患者與不利生存之間存在正相關關系，但是LI等[23]研究發現，吸煙史與非小細胞肺癌患者長期生存關系較弱。ZINRAJH等[24]研究也發現，非小細胞肺癌組織中磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶（phosphatidylethanolamine N-methyl transferase, PEMT）基因表達增加，且PEMT表達越高的患者的生存時間越短。由上可知，文獻中預測非小細胞肺癌患者生存期的學說很多。

本研究通過對96例非小細胞肺癌患者進行回顧性分析，單因素生存分析結果表明，在4組肺癌患者中，D組（Ki67和p53均低表達）中位生存時間及1、3、5年生存率均高于其他3組，同時A組（Ki67和p53均高表達）與C組（Ki67低表達、p53高表達）和D組，B組（Ki67高表達、p53低表達）與D組生存時間差異也有統計學意義。有文獻報道稱[11-12]，Ki67表達與p53有一定關系，p53促進Ki67表達，加速肺癌細胞增殖抑制凋亡；但也有文獻報道稱，Ki67與p53呈負相關，具體機制尚不清楚[13]。本研究結果提示，Ki67與p53在肺癌中可能存在拮抗作用，導致患者的生存期延長。但是Ki67和p53的單獨表達差異無統計學意義，一方面可能是因為本研究是回顧性分析，標本差異以及選擇差異等均有可能出現假陰性結果，另一方面可能是由于腫瘤惡性生物學行為的復雜性和多樣性，無法單獨利用某種檢測來解釋各種改變。本研究中還發現，患者TNM分期越低，中位生存時間越長。但是在肺癌的不同組織學分型中發現，腺癌、鱗癌、腺鱗癌、小細胞癌和大細胞癌的生存時間差異無統計學意義。在預后影響因素的Cox回歸分析中發現，TNM分期是影響肺癌預后的指標。

綜上所述，TNM分期越低，患者中位生存時間也越長，TNM分期是肺癌預后指標。Ki67和p53均低表達時，中位生存時間及1～5年生存率均高于平均水平，提示Ki67和p53聯合檢測在非小細胞肺癌中具有潛在預后作用，為闡明腫瘤標志物在肺癌診斷中的價值提供輔助依據。