以“甘潤濡養(yǎng)”立法的啟膈方抑制裸鼠食管癌肺轉(zhuǎn)移的研究

史會娟 ，薛健雄 ，石冬璇 ，孔令玉 ，李晶 *

食管癌發(fā)病有明顯的地域性差別，我國食管癌的發(fā)病率是世界平均發(fā)病率的2倍［1］。河北省磁縣、涉縣食管癌發(fā)病率和病死率均高居世界榜首［2］。而轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致食管癌患者死亡的主要原因。即使行食管癌根治術(shù)的患者約50%在術(shù)后2～3年仍會發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移［3］。我國食管癌患者的5年生存率僅為20.9%［4］。因此，尋求抑制食管癌轉(zhuǎn)移的有效方法是目前的重要課題。

本課題組長期從事食管癌防治研究，提出食管癌（噎膈）的核心病機是“血液衰耗，胃脘干槁”［5］。瘀血、痰阻、逆氣只是其不同階段派生的不同表現(xiàn)，而非噎膈之本質(zhì)。尤其對于食管癌切除術(shù)后患者，只有徹底改變“血液衰耗，胃脘干槁”的狀態(tài)，應(yīng)用“甘潤濡養(yǎng)”之法，從食管癌的本質(zhì)著手，才能徹底抑制食管癌轉(zhuǎn)移。本研究旨在探討以“甘潤濡養(yǎng)”立法的啟膈方對尾靜脈注射食管癌細(xì)胞裸鼠肺轉(zhuǎn)移的影響，并探討其作用機制，以期為以“甘潤濡養(yǎng)”立法抑制食管癌肺轉(zhuǎn)移提供更多基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及實驗動物 穩(wěn)轉(zhuǎn)Luciferase熒光素酶基因的人源性食管癌細(xì)胞株KYSE-150-Luc和熒光素酶底物購于上海科遠(yuǎn)迪生物科技有限公司；BABL/c裸鼠共21只，5周齡，體質(zhì)量18～20 g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011 NO.11400700208569，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實驗動物中心（SPF級）。

1.1.2 主要儀器及試劑 動物活體成像系統(tǒng)（NightOWL）購于德國Berthold公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶購于美國GIBCO公司；二甲基亞砜（DMSO）購于北京索萊寶科技有限公司；啟膈方藥物購自河北省石家莊市樂仁堂總店，由石家莊以嶺藥業(yè)制成水提凍干粉保存；卡培他濱片（希羅達，0.5 g×12片）產(chǎn)自上海羅氏制藥有限公司，產(chǎn)品批號SH2085。

1.2 實驗方法 本研究時間為2017年2—10月。

1.2.1 藥物制備 啟膈方提取物（QGF）制備：郁金25 g，沙參25 g，丹參15 g，浮小麥5 g，浙貝10 g，茯苓10 g，砂仁10 g，荷葉5 g，清夏10 g，天冬25 g，山藥25 g，為70 kg左右成人每人每日用量，采用水提法制備提取物凍干粉，約30 g。將凍干粉分裝并儲存于-80 ℃冰箱，應(yīng)用時用完全培養(yǎng)基配制、倍比稀釋，并用濾器過濾。按照公式：小鼠給藥劑量（mg/kg）=9.1×人（70 kg）給藥劑量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 低分化食管癌細(xì)胞株KYSE-150-Luc培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃、5% CO2、飽和濕度）連續(xù)培養(yǎng)。于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞貼壁生長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。每2～3 d換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.2.3 建立裸鼠食管癌肺轉(zhuǎn)移模型 取對數(shù)生長期的穩(wěn)轉(zhuǎn)Luciferase熒光素酶標(biāo)記的低分化食管癌細(xì)胞株KYSE-150-Luc細(xì)胞消化，1 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），制成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，用1 ml注射器接種于BABL/c裸鼠尾靜脈，每只100 μl，共接種21只。

1.2.4 分組及用藥情況 將接種癌細(xì)胞的裸鼠隨機分為對照組（7只）、卡培他濱組（7只）和啟膈方組（7只）。接種后第3天，對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃0.2 ml/d，卡培他濱組給予卡培他濱溶液（濃度400 mg/kg）灌胃0.2 ml/d，啟膈方組給予QGF溶液（濃度3 913 mg/kg）灌胃0.2 ml/d。其中卡培他濱組每灌胃2周停藥1周。3組均灌胃給藥12周，而后正常飲水、飲食。

1.2.5 動物活體成像系統(tǒng)觀測裸鼠肺轉(zhuǎn)移情況 接種后第4周應(yīng)用動物活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤情況，使用WinLight 32軟件評估信號強度。觀測前每只裸鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉（劑量為35 mg/kg），待裸鼠完全麻痹后（3～5 min）按150 mg/kg腹腔注射0.2 ml由PBS稀釋的熒光素酶底物，10 min后通過動物活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤情況。之后每2周用動物活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠轉(zhuǎn)移瘤情況。接種后第16周統(tǒng)一脫頸處死裸鼠，取肺組織，觀察各組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)大小數(shù)目，記錄裸鼠體質(zhì)量。

1.2.6 Western blotting法檢測肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織中E鈣黏蛋白（E-cad）、角蛋白（KRT）8、snail、間隙連接蛋白（Connexin）43、WNT2表達水平 接種后第16周統(tǒng)一脫頸處死裸鼠，取肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織，每組標(biāo)本取0.5 cm3小塊置于-80 ℃冰箱中備用；其余肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織置于10%福爾馬林中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，預(yù)備HE染色用。

將剪刀、鑷子等高壓滅菌后，用剪刀將組織切成綠豆大小的碎塊，后置于組織研磨器中，加入300 μl的蛋白裂解液和2 μl的苯甲基磺酰氟（PMSF），置于冰上充分研磨，并做標(biāo)記。將研磨后的組織放入1.5 ml的EP管中，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），提取上清液至另一EP管中，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的操作步驟進行蛋白定量檢測。將Cx32與5×上樣緩沖液混合均勻，100 ℃沸水浴加熱5 min使蛋白變性，冷卻后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ榛蛩徕c-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜、封固，一抗結(jié)合過夜，洗膜，二抗（Donkey Anti-Rabbit IgG H&L preadsorbed）結(jié)合。TTBS室溫洗膜3次，10 min/次，采用成像分析軟件對Western blotting顯色區(qū)帶的信號強度進行相對定量分析，掃描結(jié)果用灰度值表示。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.7 各組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察 取石蠟包埋肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織，將蠟塊切成4 μm的切片后常規(guī)脫蠟。使用蘇木素染色3 min，自來水沖洗2 min。過1%鹽酸酒精20 s后取出，自來水沖洗2 min，氨水返藍(lán)20 s，自來水沖洗2 min。伊紅溶液染色2 min，后依次進入70%酒精、80%酒精、95%酒精各5 min，無水乙醇10 min。晾干，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LDS-t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組裸鼠死亡情況 第16周末共16只裸鼠存活，5只死亡（其中對照組第73天死1只，第107天死1只；卡培他濱組第84天死1只，第109天死1只，第111天死1只）。

2.2 動物活體成像系統(tǒng)觀察結(jié)果 接種后第12周在肺部區(qū)域檢測到腫瘤細(xì)胞的生物發(fā)光信號，提示出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。其中啟膈方組和卡培他濱組光子強度均低于對照組（見圖1）。

2.3 3組體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比比較 3組第4、8、12、16周體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組、啟膈方組第4、8、12、16周體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比大于卡培他濱組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組第4、8、12、16周體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比小于啟膈方組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.4 3組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較 3組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)多于啟膈方組、卡培他濱組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；啟膈方組和卡培他濱組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

2.5 3組 肺 轉(zhuǎn) 移 結(jié) 節(jié) 組 織 中 E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT2表 達 水 平 比 較 3組 E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT2表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。啟膈方組及卡培他濱組E-cad、KRT8、Connexin43表達水平高于對照組，snail、WNT2表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；卡培他濱組E-cad、KRT8、Connexin43表達水平低于啟膈方組，snail、WNT2表達水平高于啟膈方組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3、圖2）。

表1 3組裸鼠體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比比較（x±s，%）Table 1 Ratios of baseline weight to the weight at the end of 4，8，12，16 weeks of intervention in 3 groups of nude mice

圖1 動物活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠肺轉(zhuǎn)移情況Figure 1 Lung metastasis from esophageal cancer in nude mice observed by using in vivo small animal imaging

表2 3組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較（x±s，個）Table 2 Compare the number of lung metastatic nodules between 3 groups of nude mice

2.6 形態(tài)學(xué) 肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織經(jīng)HE染色后鏡下觀察（×200）發(fā)現(xiàn)，3組裸鼠腫瘤組織均呈巢狀生長，腫瘤細(xì)胞排列密集，異質(zhì)性明顯。3組均未見明顯腫瘤細(xì)胞壞死征象，結(jié)合活體成像及肺組織表面結(jié)節(jié)數(shù)結(jié)果考慮，啟膈方組及卡培他濱組均抑制了食管癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，但在促進食管癌腫瘤細(xì)胞凋亡上效果并不明顯（見圖3）。

圖2 Western blotting法檢測3組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT 表達水平Figure 2 Western blotting results of the expression levels of E-cad，kRT8，snail，Connexin43 and WNT in lung metastases of 3 groups of nude mice

3 討論

食管癌根據(jù)其臨床表現(xiàn)，歸屬于中醫(yī)學(xué)的“噎膈”范疇。《內(nèi)經(jīng)》云“三陽結(jié)，謂之膈。飲食不下，膈噎不通，食則吐。”臨床中可觀察到食管癌患者常表現(xiàn)為大便干結(jié)、口苦咽干等胃陰衰耗征象。因此，本研究組提出食管癌的核心病機為“血液衰耗，胃脘干槁”。只有針對這一核心病機“甘潤濡養(yǎng)”，才能徹底改變患者的“干槁”狀態(tài)，防止轉(zhuǎn)移發(fā)生。啟膈方是由清代程鐘齡《醫(yī)學(xué)心悟》中的啟膈散化裁而成，以“甘潤濡養(yǎng)”立法。前期研究發(fā)現(xiàn)其能夠穩(wěn)定病灶、提高生存質(zhì)量、延長生存期［6］；初步研究發(fā)現(xiàn)啟膈方可明顯增強食管癌細(xì)胞間隙連接［7］，增強食管癌細(xì)胞間同質(zhì)黏附［8］，抑制食管癌細(xì)胞微絲骨架重構(gòu)［9］，從而降低食管癌細(xì)胞的侵襲能力及遷移能力［7-9］。

上皮細(xì)胞間質(zhì)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程［10-11］。上皮細(xì)胞通過間質(zhì)化改變使細(xì)胞同質(zhì)黏附減弱、細(xì)胞骨架重構(gòu)，從而獲得更強的遷移能力。Snail是鋅指轉(zhuǎn)錄的snail超家族的成員，是EMT的調(diào)控因子之一，具有促進細(xì)胞遷移的能力［12-13］；KRT8作為細(xì)胞骨架中間絲蛋白最大的亞型，對維持上皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有重要意義，并具有調(diào)節(jié)癌細(xì)胞信號傳導(dǎo)的功能［14］；E-cad能維持細(xì)胞間黏附的穩(wěn)定和上皮細(xì)胞的極性，抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，E-cad功能喪失可促進EMT；Connexin被認(rèn)為是一類腫瘤抑制基因。有研究證實食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移常伴有Connexin的異常定位和表達［7，15-16］。

本研究通過建立裸鼠食管癌肺轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用啟膈方后肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量低于對照組，說明啟膈方具有抑制食管癌肺轉(zhuǎn)移的作用。Western blotting結(jié)果顯示啟膈方能夠升高食管癌細(xì)胞中細(xì)胞骨架蛋白KRT8、Connexin43表達水平，降低EMT相關(guān)蛋白E-cad、snail、WNT2表達水平，說明啟膈方通過增強細(xì)胞連接的穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞骨架重構(gòu)，從而抑制EMT來進一步抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。但HE染色發(fā)現(xiàn)腫瘤組織并未出現(xiàn)明顯的壞死征象，提示啟膈方可能并不是通過細(xì)胞毒性作用來抑制食管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

圖3 裸鼠肺轉(zhuǎn)移組織形態(tài)學(xué)（HE染色，×200）Figure 3 Microscopic examination of lung metastases

表3 3組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT2表達水平比較（x ±s，灰度值/內(nèi)參灰度值）Table 3 Expression levels of E-cad，KRT8，snail，Connexin43 and WNT2 in lung metastases of 3 groups of nude mice

綜上所述，啟膈方能夠抑制食管癌肺轉(zhuǎn)移，可能與其增強裸鼠間隙連接、抑制EMT有關(guān)，且啟膈方在控制裸鼠體質(zhì)量減輕上效果明顯優(yōu)于卡培他濱。