細胞間黏附分子-1和多聚免疫球蛋白受體在唾液腺上皮細胞中的表達及臨床意義

黃 麗，孫傳孔，彭若冰，劉志明，毛甜甜，彭友儉

(武漢大學人民醫院，湖北 武漢 430060)

干燥綜合征屬于一種慢性炎癥性自身免疫性疾病, 其發病機制尚不明確，病變常累及唾液腺等部位[1]。細胞間黏附分子-1(ICAM-1)參與免疫反應的發生及自身免疫的全過程，其在類風濕關節炎等多種自身免疫性疾病中存在高表達[2]。多聚免疫球蛋白受體(pIgR) 為免疫球蛋白超家族中的一員, 是多聚免疫球蛋白A(pIgA) 和多聚免疫球蛋白M(pIgM) 的特異性受體[3-4]。目前針對ICAM-1和pIgR與干燥綜合征關系的研究報道尚少。本研究旨在通過觀察ICAM-1、pIgR在干燥綜合征患者唾液腺上皮細胞中的表達情況，初步探討ICAM-1、pIgR在干燥綜合征發病中的作用。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇我院2016年9月—2017年3月收治的干燥綜合征患者50例為研究組，均符合干燥綜合征的診斷標準，排除合并腫瘤及心、腦等重要器官疾病者。其中男30例，女20例；年齡26～67 (38.2±2.1)歲。同時選擇40例年齡、性別與研究組相匹配的健康體檢者為對照組，男24例，女16例；年齡27～66 (37.8±1.6)歲。2組受試對象均自愿參加研究，并簽署知情同意書。本研究方案經醫院倫理委員會審核通過。

1.2研究方法

1.2.1唾液腺組織上皮細胞的收集及培養 在局部麻醉下,從受試對象的下唇黏膜處取出微小的唾液腺組織, 運用無菌磷酸緩沖液沖洗3次，切割成 1 mm3大小的小塊。然后將每小塊組織置于含有氫化可的松、青霉素、 鏈霉素、牛腦垂體提取物等無血清培養基中, 并于37 ℃、5% CO2條件下傳代培養。當培養的唾液上皮細胞達到90 %融合后用于實驗。

1.2.2ICAM-1、pIgR mRNA表達檢測 采用RT-PCR法測定。以TRIzol試劑提取唾液腺上皮細胞中的總RNA。采用TAKAR公司反轉錄試劑盒，用提取和RNA來進行反轉錄合成cDNA，cDNA樣品用PCR儀進行PCR擴增反應。引物設計由上海吉然生物科技有限公司完成。PCR擴增條件:首先94 ℃ 4 min 變性,繼之94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個循環,最后延伸72 ℃ 10 min。反應結束后，取10 μL反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀采集照片并進行掃描，以β-actin為內參，分析ICAM-1、pIgR mRNA表達水平。

1.2.3ICAM-1、pIgR蛋白表達檢測 采用鏈親和素-生物素-免疫過氧化物酶法對唾液腺冰凍切片進行免疫組化分析。冰凍切片采用丙酮固定，加入鼠抗人pIgR或ICAM-1 單抗,在4 ℃條件下過夜。采用PBS 沖洗3次，每次5 min,滴入生物素化的兔抗鼠二抗,在室溫下放置1 h。再用PBS沖洗3次，每次5 min,滴入辣根過氧化物酶標記的鏈親和素，采用DAB顯色，脫水，封片。200倍顯微鏡下采集照片，以棕褐色顆粒為陽性信號，結果采用Image J軟件分析，計算光密度值(IOD)，以IOD/Area比值為相對表達量。

1.3統計學方法 數據應用SPSS 21.0統計軟件進行分析。計量數據采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組唾液腺上皮細胞中ICAM-1mRNA、pIgR mRNA表達情況比較 研究組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 mRNA 表達水平明顯高于對照組(P<0.05), pIgR mRNA 表達水平明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 mRNA和pIgR mRNA 表達量比較

注：①與對照組比較，P<0.05。

2.22組唾液腺上皮細胞中ICAM-1、pIgR蛋白表達情況比較 研究組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)， pIgR蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，見表2及圖1～4。

表2 2組唾液腺上皮細胞中ICAM-1和pIgR蛋白表達水平比較

注：①與對照組比較，P<0.05。

圖1 對照組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 蛋白表達情況(×200)

3 討 論

唾液腺上皮細胞的異常活化與干燥綜合征炎癥過程的發生及發展有關[5-6]，故積極探討唾液腺上皮細胞中相關因子的表達情況對明確干燥綜合征的發病機制有重要意義。淋巴細胞灶發生浸潤是誘發局部免疫反應的一個重要表現[7-8]，而ICAM-1在炎癥介導與機體免疫應答、淋巴細胞歸巢等方面扮演著十分重要的角色[9]。本研究結果顯示， 研究組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 mRNA 表達水平和ICAM-1 蛋白表達水平均明顯高于對照組,提示干燥綜合征患者存在ICAM-1高表達， ICAM-1可能使非淋巴細胞發生放大炎癥反應，進而誘發干燥綜合征炎癥的發生。

圖2 研究組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 蛋白表達情況(×200)

圖3 對照組唾液腺上皮細胞中pIgR蛋白表達情況(×200)

圖4 研究組唾液腺上皮細胞中pIgR蛋白表達情況(×200)

pIgR基因全長19 kb,含有11 個外顯子,位于染色體1q31- q41,啟動子區有ISRE、AP-1、NF-κB 和類固醇激素等結合位點[10-11]。該基因編碼693 個氨基酸, 蛋白分子量90～100 kD, 成熟片段100～120 kD。蛋白結構中有5 個Ig 樣亞單位, 分為胞外區、跨膜區、胞內區[12]。pIgR介導多聚免疫球蛋白在上皮細胞內的轉運，參與人唾液分泌型IgA (S-IgA)的形成。唾液中的游離SC即pIgR自身的裂解片斷和S-IgA是口腔防御系統的組成成分，與齲病、牙周病、黏膜病等疾病密切相關。SC/pIgR是適應性免疫和先天性免疫應答的關鍵，一方面，它負責S-IgA的分泌，是S-IgA的組成成分之一，甚至轉運已經侵入固有層的病毒或外來抗原，使機體有效地發揮黏膜適應性免疫防御作用；另一方面，游離SC也可能是非特異性免疫分子，參與機體先天性免疫防御[13]。但是多年來研究一直傾向于SC的主要作用是保護S-IgA不被水解酶降解，而忽略了游離SC/pIgR自身的免疫防御功能[14-15]。本研究結果顯示，研究組唾液腺上皮細胞中pIgR mRNA 表達水平和pIgR蛋白表達水平均明顯低于對照組,提示干燥綜合征患者唾液腺可能由于pIgR的低表達而處于免疫活化狀態。

綜上所述，ICAM-1、pIgR 異常表達與干燥綜合征密切相關，ICAM-1 高表達及pIgR 的低表達可能是誘發干燥綜合征的一個重要發病機制。