用免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜熒光法檢測山楂干中多種黃曲霉毒素含量的效果觀察

蘇小潔，潘顯茂

（1.海口市藥品不良反應監測中心，海南 海口 570311；2.海南省藥物研究所，海南 海口 570311）

山楂是薔薇科山楂屬核果類植物，又叫山里果或山里紅[1]。山楂的核質硬，果肉薄，味微酸澀，其果實可生吃或制作成果脯、果糕。山楂經干制后可入藥，具有調節血壓和血脂、增強心肌細胞和免疫系統的功能、促消化等功效[2]。研究發現，山楂中的黃酮類化合物具有較強的抗癌作用，能夠抑制人體內癌細胞的生長、增殖及轉移[3]。黃曲霉毒素是由黃曲霉菌株生成的次生代謝產物。該物質具有極強的毒性，可損傷人及動物肝臟的功能，嚴重的可引發肝癌[4-5]。因此，檢測山楂干中黃曲霉毒素的含量十分必要。本次研究主要探討用免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜熒光法檢測山楂干中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2含量的效果。

1 儀器與試劑

本次實驗使用的儀器是島津LC-20AT二元梯度高效液相色譜儀(包括SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、CBM-20A系統控制器、RF-20A熒光檢測器)、CRV-6A島津化學反應單元系統、AUW220D島津電子天平、美國維康VICAM AflaTest黃曲霉毒素分析免疫親和柱。本次實驗使用的試劑是黃曲霉毒素混合標準溶液（中國食品藥品檢定研究院提供，批號：610001-201301，黃曲霉毒素混合標準溶液中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的含量分別為0.04μg/ml、0.35μg/ml、1.18μg/ml、0.59μg/ml）、甲醇、乙腈、超純水。山楂干樣品購于超市，產自河北。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

本次實驗的色譜柱是Agilent TC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 um）， 其 流 動 相 為 甲 醇 -乙 腈 -水（40:20:40），其流速為0.8 ml/min，其柱溫為40℃，其熒光激發的波長為360 nm，其發射波長為450 nm，其進樣量為20 ul。色譜圖見圖1。

圖1 本次實驗的色譜圖

2.2 進行柱后碘衍生化的方法

本次實驗使用的衍生溶液是濃度為0.05%的碘溶液（將0.5 g的碘加入到100 ml的甲醇溶液中進行溶解，對此溶解液進行稀釋、定容至1000 ml），衍生化泵的流速為0.3 ml/min，進行碘衍生化處理的溫度為70℃。

2.3 制備對照品溶液的方法

精密量取0.5 ml的混合對照溶液（包含1.04μg/ml的黃曲霉毒素B1、0.35μg/ml的黃曲霉毒素B2、1.18μg/ml的黃曲霉毒素G1和0.59μg/ml的黃曲霉毒素G2），將其置于容量為10 ml的容量瓶中，用甲醇溶液將其稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取1 ml的貯備溶液，將其置于容量為25 ml的容量瓶中，用甲醇將其稀釋至刻度，即得對照品溶液。

2.4 制備供試品溶液的方法

精密稱取15 g的山楂干供試品粉末（過二號篩），將其置于均質瓶中。在均質瓶中加入3 g的氯化鈉和75 ml濃度為70%的甲醇溶液。對此混合溶液進行高速攪拌2 min，并進行5 min的離心處理。精密量取15 ml的上清液，將其置于容量為50 ml的容量瓶中，對其進行定容，并搖勻。用孔徑為0.45μm的微孔濾膜對混合溶液進行濾過處理。取20.0 ml的續濾液，以3 ml／min的流速通過免疫親和柱，用20 ml的超純水進行洗脫處理，棄去洗脫液。在剩余的溶液中持續打入空氣，將其中的超純水擠出免疫親和柱，再用少量的甲醇溶液對其進行洗脫。收集洗脫液，將其置于容量為2 ml的容量瓶中，用甲醇溶液將其稀釋至刻度，并搖勻，即得供試品溶液。

3 結果

3.1 進行線性關系實驗的結果

分別精密量取 5μl、10μl、15μl、20μl、25μl的混合對照品溶液，將這些混合對照品溶液注入到液相色譜儀中，測定峰面積。以峰面積（X）作為橫坐標，以進樣量（Y，ng）作為縱坐標，繪制標準曲線。得到黃曲霉毒素的線性回歸方程。黃曲霉毒素的線性回歸方程是：黃曲霉毒素B1:Y =0.0006X-0.3344（R2=0.9998），其線性范圍為0.6～50 pg；黃曲霉毒素B2:Y =0.0004X+0.0898（R2=0.9996），其線性范圍為0.1～15 pg；黃曲霉毒素G1:Y=0.0006X+0.1159（R2=1），其線性范圍為0.7～50 pg；黃曲霉毒素G2:Y=0.0006X-0.156（R2=0.9997），其線性范圍為0.2～15 pg。

3.2 進行精密度實驗的結果

精密量取20μl的混合對照品溶液，連續進樣6次。結果顯示，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的峰面積RSD分別為0.7%、1.0%、0.8%、0.6%，表明本法的精密度良好。

3.3 進行穩定性實驗的結果

按照2.4中的方法制備供試品溶液。在供試品溶液中加入1.0 ml的混合對照品溶液。在2.1的色譜條件下，分別在第0 h、第2 h、第4 h、第16 h、第24 h時進樣。結果顯示，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的峰面積RSD分別為1.2%、0.7%、0.9%、0.4%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

3.4 進行重復性實驗的結果

按照2.4中的方法制備6份供試品溶液。在這6份供試品溶液中分別加入1.0 ml的混合對照品溶液。結果顯示，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的峰面積RSD分別為1.2%、1.7%、1.8%、2.0%，表明本法的重復性良好。

3.5 進行檢測限實驗的結果

按照比例稀釋混合對照品溶液。當信噪比為3：1時，將注入儀器中混合對照品溶液的量確定為檢測限。測得黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的檢測限分別為0.2 pg、0.04 pg、0.2 pg、0.07 pg。

3.6 進行加樣回收率實驗的結果

稱取同一批次的6份陰性樣品粉末，每份陰性樣品粉末的重量為15 g。在這些陰性樣品粉末中分別加入0.5 ml的對照品貯備液，按照2.4中的方法制備供試品溶液。進樣測定并計算供試品溶液的加樣回收率。測得黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的平均回收率分別為89.9%、86.2%、84.1%、79.4%。

3.7 進行樣品含量測定的結果

取5 批樣品，每批樣品各15 g，按照2.4中的方法制備。進樣測定并計算供試品溶液中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的含量。結果見表1。

表1 進行樣品含量測定的結果（μg/kg）

4 討論

本次實驗的結果顯示，在這5批山楂干樣品中，有1批山楂干樣品被檢出含有黃曲霉毒素B1。這批山楂干樣品中黃曲霉毒素B1的含量雖然未達到《藥典》中對黃曲霉毒素的限量（每1000 g藥材中含有黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G 1、黃曲霉毒素G2的總量不得超過10μg），但它提示我們，山楂干樣品有被黃曲霉毒素污染的可能。因此檢測山楂干中黃曲霉毒素含量十分必要。

綜上所述，免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜熒光法簡便、準確、重復性好,可用于測定山楂黃曲霉毒素的含量。