家兔卵巢組織玻璃化冷凍保存的實驗研究

覃穎，李慕軍

(廣西醫科大學第一附屬醫院生殖醫學研究中心，南寧 530021)

為了避免放化療對女性癌癥患者卵巢的損傷[1]，在放化療前將卵巢組織冷凍保存，治療結束后再移植回體內或是行卵巢體外培養，將有可能保存卵巢內大量的原始卵泡儲備。另外，相對于胚胎和卵子冷凍，卵巢冷凍保存不需要藥物促排卵，不存在誘發某些腫瘤惡變的可能。因此它特別適用于不宜接受卵巢刺激的癌癥患者及青春期前的女孩[2-3]。同時，近年來，由于社會及經濟原因，使得越來越多的女性結婚及生育的年齡推后[4]。因此年輕女性有望通過卵巢冷凍保存的方式自主選擇自己的生育年齡。

相比于最開始的卵巢組織慢速程序化冷凍法，玻璃化冷凍方法作為一種新興的冷凍保存技術，其目的是使細胞內液體形成玻璃化狀態以避免細胞內冰晶形成所造成的對細胞膜和細胞器的機械損傷。Yeoman等[5]研究表明玻璃化冷凍能有效保存猴的卵巢組織，其效果與慢速冷凍法無顯著差異。Sanfilippo等[6]采用冷凍管式玻璃化冷凍法保存人類卵巢組織，顯示此方法可以使卵泡正常率達到83.6%，且和慢速冷凍法的保存效果無顯著差異。Chen等[7]報道新型直接覆蓋玻璃化方法(DCV)，降溫速率可達15 000℃/min，其對卵巢的保存效果優于傳統的玻璃化冷凍方法。半麥管玻璃化冷凍法(HS)由Keros等[8]設計并且成功保存了卵巢組織。本研究選擇DCV法和HS法冷凍保存家兔卵巢組織，研究比較這兩種冷凍方法的保存效果。

材料與方法

一、實驗步驟及主要試劑

1.動物來源：選用健康的新西蘭雌性家兔10只，月齡4～5月，體重2～2.5 kg，由廣西醫科大學實驗動物中心提供動物實驗場地及技術支持。

2.主要試劑：二甲基亞砜(DMSO，Amresco，美國)，乙二醇(EG，廣東西隴)，蔗糖(廣東光華科技)，PBS(上海生工生物)。配制玻璃化冷凍所需的預凍液(7.5%EG+7.5%DMSO+PBS)、冷凍液(15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L蔗糖+PBS)及復蘇溶液(依據濃度梯度依次為含1.0 mol/L、0.5 mol/L和0.25 mol/L蔗糖的PBS)。

二、實驗方法

1.卵巢的獲取：經家兔耳緣靜脈注射空氣處死雌兔，取出其雙側卵巢并立即放入無菌PBS中。在盛放有PBS的培養皿中反復漂洗以祛除組織中的血跡，并切除卵巢周圍的脂肪和結締組織。用薄刀片小心刮去卵巢髓質后，剩下的卵巢皮質用眼科剪切割成大小約2 mm × 2 mm × 1 mm的組織塊。隨機取每只雌兔2～3塊卵巢組織塊置于10%中性福爾馬林液中固定保存作為新鮮對照組，剩余的卵巢組織塊被再次隨機分配到DCV組和HS組中。

2.制作半麥管：用眼科剪將0.25 ml麥管的開口端剪成長寬約0.8 mm× 0.3 mm的薄片。制作好的半麥管浸泡于75%酒精中6～8 h，晾干以備用。

3.卵巢組織的玻璃化冷凍：(1)DCV組：我們參考chen等[7]的實驗步驟，首先將卵巢組織塊置于預凍液中在室溫下滲透平衡10 min，再將其移入冷凍液中浸泡2 min。將2～3塊卵巢組織放置于冷凍管底部后，借助無菌長鑷子迅速將冷凍管浸入液氮中，并確保冷凍管與液氮液面之間的角度要大于45度，這樣冷凍組織塊表面會附著少量的冷凍液，其表面的冷凍液能使組織塊迅速固化并且粘附在冷凍管壁上或是半麥管上，以防止卵巢組織塊漂走，隨后迅速用長鑷子在液氮中將冷凍管的蓋子蓋上旋緊，并置于液氮中保存。(2)HS組：卵巢組織塊同樣先置于預凍液中滲透平衡10 min，再浸于冷凍液中2 min。用眼科鑷子將2～3塊卵巢組織塊放置到半麥管開口端的薄片上，然后借助無菌長鑷子迅速將半麥管浸入盛放有液氮的淺容器中，浸入液氮時半麥管與液面的傾斜度大于45度?？匆娊M織塊成透明玻璃化冷凍狀態后，迅速將半麥管放入旁邊同樣浸于液氮中的冷凍管內，在液氮中旋緊冷凍管的蓋子后并置于液氮中保存。

4.復蘇冷凍的卵巢組織：于液氮中放置1周后將卵巢組織塊解凍復蘇。

DCV組：從液氮罐中取出存放有卵巢組織的凍存管，迅速將其投入37℃水浴直至組織塊表面的冰層完全溶解，室溫下將卵巢組織從冷凍管中取出后依次移入濃度為1.0、0.5和0.25 mol/L蔗糖的PBS中各浸泡5 min，再用PBS漂洗組織塊5 min×2次后，將其放入10%福爾馬林中浸泡固定。

HS組：在液氮中用長鑷子將冷凍管蓋子旋開后取出冷凍管內的半麥管，立即將半麥管迅速投入37℃的含1.0 mol/L蔗糖的PBS中浸泡5 min，隨后置于半麥管尖端平面處的卵巢塊將迅速解凍，解凍軟化后的卵巢塊就可以從半麥管上脫落下來，漂浮于蔗糖溶液中。隨后，在室溫下將組織依次移入含0.5、0.25 mol/L蔗糖的PBS中各5 min。最后，將卵巢組織移入PBS中，室溫下充分洗滌5 min×2次后，將其浸于10%福爾馬林中固定。

5.對冷凍復蘇后的卵巢組織進行評估：(1)組織形態學評估：每個組各取20個卵巢組織塊，這些組織塊在經過10%中性福爾馬林液浸泡固定、二甲苯透明、各級濃度酒精逐級脫水后，用石臘將卵巢組織塊包埋，將制成的石蠟塊進行連續4 μm切片后行HE染色。連續切片中每隔10張取一張在光學顯微鏡下根據Gougeon[9]的標準觀察以單盲法觀察卵泡的形態，并分別計數每張切片中形態正常及異常的原始卵泡和初級卵泡。(2)制備電鏡標本：每個組各取2個組織塊行2.5%戊二醛(pH=7.4)于4℃固定，送往廣西醫科大學電鏡室制做成電鏡標本。在透射電子顯微鏡下觀察比較各組中組成卵泡的卵母細胞、顆粒細胞及周邊間質細胞的超微結構。

三、數據統計學分析

所有數據均用SPSS 13.0統計學軟件進行分析。采用χ2檢驗評判各組間統計學差異，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

一、凍融前后卵巢組織形態的觀察與比較

1.各組卵泡形態學比較：組織形態學結果顯示，DCV冷凍組和HS冷凍組卵巢均遭受不同程度的冷凍損傷。形態正常的卵泡的卵母細胞均保持圓形或橢圓形的結構，未見細胞漿皺縮，未見核固縮，卵母細胞周圍的顆粒細胞排列緊密分布均勻，卵泡基底膜完整。相反，形態異常的卵泡卵母細胞形狀欠規則，發生細胞漿皺縮和核固縮，且胞漿內出現大量空泡；周圍顆粒細胞排列松散甚至缺失，發生核固縮；基底膜部分斷裂或缺失。各組中形態正常與形態異常的卵泡如圖1所示。凍融前后卵泡形態正常率的變化情況如表1所示。

2.卵巢組織中原始卵泡和初級卵泡形態的正常率和異常率分析：結果顯示，相比新鮮對照組，兩個冷凍組中卵巢組織在復蘇后其原始卵泡的形態正常均顯著下降，其異常率較新鮮組顯著升高(P<0.05)；初級卵泡的形態正常率較新鮮組均有顯著下降(P<0.05)，其異常率較新鮮組均顯著上升(P<0.05)；然而，兩個冷凍組的原始卵泡及初級卵泡的形態正常率相比較并無顯著差異(P<0.05)(表1)。同時，在這兩個冷凍組初級卵泡形態正常率的下降較原始卵泡更為明顯(P<0.05)。

A：新鮮組中形態正常的原始卵泡(→)和初級卵泡()；B：DCV組中形態正常的原始卵泡；C：DCV組形態異常的原始卵泡；D：HS組形態正常的初級卵泡；E：HS組中形態異常的初級卵泡；各圖右上角為各自的低倍全景圖圖1 凍融復蘇后卵巢內卵泡的組織形態學觀察(HE染色，×400)

組 別原始卵泡數原始卵泡正常異常初級卵泡數初級卵泡正常異常新鮮組227200(88.11)*27(11.89)*7051(72.86)*19(27.14)*DCV組289210(72.66)79(27.24)9653(55.21)43(44.79)HS組283203(71.73)80(28.27)8950(56.18)39(43.82)

注：與其他兩組比較，*P<0.05

二、電鏡下超微結構的觀察與比較

每組分別選取2塊組織塊(所有實驗組卵泡數合計為20個卵泡)于透射電鏡下觀察的超微結構。結果顯示，新鮮組卵泡(6個)的超微結構完好；DCV組和HS組卵泡(各7個)表現為細胞核的核膜斷裂或缺失不完整，核內染色質邊集；線粒體異常腫脹以致嵴減少或消失；內質網明顯擴張；大量空泡出現于細胞漿內。在DCV組中有3個卵泡的基底膜發生斷裂，在半麥管組中也有2個卵泡基底膜發生斷裂(圖2)。

進一步對兩個冷凍組中卵母細胞、顆粒細胞和間質細胞分別在不同部位發生損傷的細胞數目進行統計分析(線粒體發生損傷定義：細胞內發生損傷的線粒體的數目/線粒體的總數≥50%)，結果表明，對于細胞核的損傷，DCV組和HS組的卵泡，除了卵母細胞的細胞核無損傷，有一部分顆粒細胞和間質細胞的細胞核發生了損傷，DCV組中顆粒細胞和間

A：新鮮對照組中的正常卵泡(×8 000)，形態正常的卵母細胞(O)、細胞漿內形態正常的線粒體(M)、形態正常的顆粒細胞(GC)；B：HS組形態正常的卵泡，卵泡結構完整(×4 000)；C：HS組O細胞膜完整，M形態基本正常；GC細胞膜、核膜均完整，GC核內常染色質分布均勻無邊集；GC與O連接緊密，基底膜(BM)完整；間質細胞(S)胞膜完整，核內染色質分布均勻，與GC連接緊密(×15 000)；D：HS組，卵母細胞胞漿內的滑面內質網(ER)異常擴張，部分線粒體形態正常嵴清晰，部分線粒體腫脹、嵴減少或消失(×20 000)；E：DCV組，可見GC細胞漿里出現空泡、核膜完整、核內染色質發生濃縮邊集，M腫脹、嵴消失，BM出現裂隙不連續(×15 000)；F：DCV組，卵母細胞胞漿內部分M腫脹、嵴數目減少或消失，M內電子密度降低(×15 000)圖2 凍融復蘇后卵巢內卵泡的超微結構觀察

質細胞中細胞核發生損傷的細胞顯著高于HS組(P<0.05)。對于存在線粒體損傷的細胞數占各自細胞總數的百分比，DCV組卵泡的卵母細胞、顆粒細胞和間質細胞均顯著高于HS組(P<0.05)；對于存在內質網損傷的細胞數占各自細胞總數的百分比，DCV組卵泡的卵母細胞、顆粒細胞和間質細胞與HS組無顯著性差異(P>0.05)；對于存在胞漿內空泡損傷的細胞數占各自細胞總數的百分比，DCV組卵泡的卵母細胞、顆粒細胞和間質細胞均顯著高于HS組(P<0.05)(表2)。

表2 兩種冷凍方法對卵泡3種細胞不同部位的損傷情況[損傷的細胞數/細胞總數，n(%)]

注：與DCV法相應細胞部位比較，*P<0.05

討 論

要實現玻璃化狀態，必須具備兩個條件：(1)通過調整組織塊大小和合理冷凍載體的設計以實現足夠快的降溫速率。(2)通過調整平衡液中冷凍保護劑的種類、濃度、滲透平衡的時間和溫度，以提高細胞內冷凍保護劑的濃度促進粘稠玻璃化狀態的形成，但同時也不可忽視過高濃度的冷凍劑對細胞的毒性。結合這兩個關鍵因素，1 μl冷凍保護劑的總濃度為40%～60%(W/V，質量/體積濃度)時，降溫速率必須達到1 000℃/min以上才能形成玻璃化狀態。傳統的玻璃化冷凍多采用凍存管或閉合式麥管作為冷凍載體，因冷凍速率較低因而無法實現理想的冷凍效果。近年來，各國學者為了提高玻璃化冷凍降溫速度嘗試了多種新的冷凍方案。Santos等[10]提出的固體表面玻璃化冷凍法(SSV)，將含有卵巢組織的冷凍液滴在液氮中預冷的固體表面實現玻璃化，卵泡保存效果優于傳統玻璃化冷凍法。Isachenko等[11]直接將含組織塊的冷凍保護劑以微滴的形式滴入液氮中，這種無載體的微滴式玻璃化冷凍法，其降溫速率可提高到20 000℃/min以上，因此也稱為超速玻璃化冷凍法。Wang等[12]則提出針浸潤玻璃化冷凍法(NIV)，其冷凍效果優于傳統慢速冷凍法和微滴法。近年來，有研究指出，玻璃化冷凍對于卵泡的顆粒細胞及卵巢間質細胞具有明顯的保護作用，效果可以等同甚至優于慢速冷凍法[13-14]。進一步，有研究指出雖然采用玻璃化冷凍的原始卵泡的正常率與慢速冷凍法相比沒有明顯差異，但是玻璃化冷凍的卵泡DNA斷裂明顯少于慢速冷凍法[15]。

本研究采用DCV法和半麥管法這兩種新型的玻璃化冷凍方案進行冷凍，這兩種方案均是讓組織塊直接與液氮接觸，以達到快速降溫的目的，但兩種方案的冷凍操作方式不同。在DCV法的操作過程中關鍵在于要讓液氮以最快的速度覆蓋接觸組織塊。在實際操作中發現，在保證組織塊不會因為反沖力而沖出冷凍管的范圍，盡可能將組織塊放置于距離冷凍管口越近的位置，并且浸入液氮時冷凍管壁與液面所成的角度越小，則液氮覆蓋組織塊所需要的時間就越短，降溫速率就越快。但液氮的覆蓋時間從冷凍管口底部畢竟存在時間差，不及半麥管法那樣與液氮的接觸直接和迅速。這兩種方案的冷凍相比新鮮對照組，其原始和初級卵泡的形態正常率雖然均有所下降，但仍能保持較高的原始卵泡形態正常率(72.66%和71.73%)。在兩個冷凍組中，初級卵泡的形態正常率均明顯低于原始卵泡，表明玻璃化冷凍方案更適合保存體積小、代謝率低、細胞器少的原始卵泡。兩個冷凍組間原始和初級卵泡的形態正常率無明顯差異，說明DCV法與半麥管法冷凍方案對卵泡組織學形態的影響差別不大。

本研究中在液氮冷凍卵巢組織1周后解凍后進行研究，并未有延長冷凍時間。在本課題組既往研究發現冷凍1周和冷凍1個月對卵泡的影響無顯著差異。可能的原因是，玻璃化冷凍是一瞬間短暫的過程，也就是說冷凍成功的關鍵與否在于浸入液氮一瞬間的操作手法，能使卵巢塊能夠在浸入液氮的一瞬間成功的玻璃化，而不是冰晶化。一旦組織塊已經在液氮中形成玻璃化狀態，那么在這樣的極低溫狀態下，卵巢的內部細胞活動已經停止，因此只要一直浸在液氮當中，無論冷凍保存的時間長短，卵巢內部的組織形態都不會發生變化。

本實驗研究發現，經DCV法和半麥管法這兩種玻璃化冷凍方案凍融后的卵巢組織與新鮮組比較，卵泡的超微結構均有不同程度的損傷。結果表明：(1)兩種冷凍方案對細胞核的超微結構損傷最小。細胞核的損傷意味著細胞失去固有生命功能和發生凋亡的趨勢加快。因此，這兩種玻璃化冷凍方案對細胞核具有較好的保存效果，并未對細胞產生致命性的冷凍損傷。(2)兩種冷凍方案均對細胞器線粒體損傷最為嚴重，說明線粒體對冷凍損傷最為敏感。

本研究中采用的DCV法和半麥管法均能有效保存家兔的卵泡，且這兩種冷凍方案在動物實驗成功的基礎上，有望運用于人類卵巢的保存，提高其臨床應用性[16]，當然，這仍需要從更多方面去評估和驗證。